野野村放线菌ATCC 39727利用短链羧酸合成细胞脂肪酸

2021-03-01李志超张广昊

大连工业大学学报 2021年1期

李志超，张广昊，黄雁，陈明

(大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034)

0 引言

脂糖肽抗生素A40926是抗感染新药Dalvance的合成前体[1-2]，由野野村放线菌(Nonomuraeasp.)ATCC 39727代谢生成[3-4]。A40926为A0、A1、B0、B1等组分构成的复合物，化学结构上与替考拉宁相似，均含有交联七肽骨架、两个氯原子、一个甘露糖和一个脂酰氨基葡萄糖酸，但各组分连接的疏水脂酰侧链不同[5-6]。研究表明，脂酰侧链能大大提高A40926的抑菌活性[7]。

然而，A40926生物合成基因簇中并不含合成脂酰侧链的基因[8]。Beltramatti和Jovetic等[9-10]研究了培养基中添加支链氨基酸对野野村放线菌细胞脂肪酸和A40926各组分比例的影响，发现A40926各组分比例与生产菌细胞脂肪酸组成在变化趋势上存在一致性，推测细胞脂肪酸经β-氧化后生成A40926的脂酰侧链，而支链氨基酸则作为细胞脂肪酸合成的前体物。

Wallace等[11]研究了3种放线菌细胞直链、支链脂肪酸生物合成的起始物，认为放线菌支链脂肪酸的生物合成以异丁酰CoA(对应生成偶数碳的iso-脂肪酸)、3-甲基丁酰CoA(对应生成奇数碳的iso-脂肪酸)、2-甲基丁酰CoA(对应生成奇数碳的anteiso-脂肪酸)为合成起始物，直链脂肪酸的合成以丁酰CoA(对应生成偶数碳的n-脂肪酸)、丙酰CoA(对应生成奇数碳的n-脂肪酸)为合成起始物。Nonomuraeasp.ATCC 39727作为一种新发现的放线菌，对其生物特性研究较少[12]。本实验对该菌利用短链羧酸合成细胞脂肪酸进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

Nonomuraeasp.ATCC 39727，实验室保藏。

1.1.2 培养基

培养基ISP2(g/L)：葡萄糖4.0，酵母提取物4.0，麦芽提取物10.0，琼脂20.0，pH 7.0。

培养基P150(g/L)：葡萄糖20，(NH4)2SO43.65，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.45，CaCO35，每升加入3 mL微量元素液(g/L，FeSO4·7H2O 5，CuSO4·5H2O 0.39，ZnSO4·7H2O 0.44，MnSO4·H2O 0.15，CuCl20.02，NaMoO4·2H2O 0.011，50 mL 37% HCl)。

培养基P150中分别添加短链羧酸(丙酸、丁酸、异丁酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸)，质量浓度0.3 g/L。

1.1.3 试剂与仪器

三氟化硼-甲醇，上海安谱科学仪器有限公司；丙酸、丁酸、异丁酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、甲醇、正己烷，均为分析纯。

气质联用仪，Agilent Technologies GC-MS 7890/5795。

1.2 方法

1.2.1 菌体培养

取-80 ℃冰箱中甘油管菌种，涂布至培养基ISP2平板，28 ℃培养7～8 d，挑取单菌落至装有2 mL无菌水的试管中，加入几粒玻璃珠，对菌体进行振荡破碎，取1 mL菌悬液接入25 mL合成培养基中，28 ℃、200 r/min培养72 h。

1.2.2 细胞脂肪酸的甲酯化及组分的GC-MS分析

方法见参考文献[12]。

2 结果与讨论

2.1 培养基P150中菌体细胞脂肪酸组成

菌体经合成培养基P150培养后，对菌体的细胞脂肪酸组成进行GC-MS分析，图1为培养基P150培养菌体细胞脂肪酸的总离子色谱图。结果表明，共检出9种主要脂肪酸，以偶数碳直链脂肪酸为主，C16：0脂肪酸质量分数最高(22.08%)，C14：0、C16：1、C16：0、C18：0 4种偶数碳直链脂肪酸质量分数占总脂肪酸的47.76%；偶数碳支链脂肪酸i-C16：0质量分数达21.89%，i-C14：0和i-C16：0两种脂肪酸质量分数达27.04%；奇数碳的i-C15：0、C15：0、a-C17：0脂肪酸同时被检出，质量分数见表1。

图1 培养基P150中细胞脂肪酸总离子色谱图Fig.1 FAME GC-MS profile of Nonomuraea sp.ATCC 39727 cells grown in medium P150

表1 菌体细胞脂肪酸组成Tab.1 Cell fatty acids composition of Nonomuraea sp.ATCC 39727 %

2.2 添加丙酸对菌体细胞脂肪酸组成的影响

图2为合成培养基P150添加0.3 g/L丙酸后菌体细胞脂肪酸的总离子色谱图。与图1相比，添加丙酸后细胞脂肪酸组成发生了很大变化，奇数碳直链脂肪酸质量分数显著增加，其中C15：0 脂肪酸质量分数由原来的5.96%增加到19.64%，原来未检出C17：0脂肪酸，后达6.86%(表1)，这可能是丙酰CoA为奇数碳直链脂肪酸合成起始物所致；添加丙酸后，C14：0、C16：1、C16：0等偶数碳直链脂肪酸及anteiso-C17：0脂肪酸质量分数显著降低，但C18：0脂肪酸质量分数大幅度增加。

图2 添加丙酸菌体的脂肪酸总离子色谱图Fig.2 FAME GC-MS profile of Nonomuraea sp.ATCC 39727 cells grown in medium P150 supplemented with propionic acid

2.3 添加丁酸对菌体细胞脂肪酸组成的影响

图3为合成培养基P150添加0.3 g/L丁酸后菌体细胞脂肪酸的总离子色谱图。与图1相比，添加丁酸后细胞脂肪酸组成变化不大，添加丁酸后，C16：0脂肪酸质量分数下降，C18：0脂肪酸质量分数增加，C14：0、C16：1、C16：0、C18：0等4种偶数碳直链脂肪酸质量分数占总脂肪酸质量分数的50.70%，质量分数变化不大(见表1)，说明添加丁酸对偶数碳直链脂肪酸的合成起始物丁酰CoA质量分数的影响并不大。

图3 添加丁酸菌体脂肪酸总离子色谱图Fig.3 FAME GC-MS profile of Nonomuraea sp.ATCC 39727 cells grown in medium P150 supplemented with butyric acid

2.4 添加异丁酸对菌体细胞脂肪酸组成的影响

图4为合成培养基P150添加0.3 g/L异丁酸后菌体细胞脂肪酸的总离子色谱图。与图1相比，添加异丁酸后细胞脂肪酸组成发生了很大变化，偶数碳支链脂肪酸i-C16：0质量分数显著增加，为质量分数最高的脂肪酸，同时C16：0脂肪酸质量分数显著下降(表1)。异丁酰CoA为i-C16：0 脂肪酸合成起始物，异丁酸的添加导致了i-C16：0脂肪酸质量分数的显著增加，同时导致偶数碳直链脂肪酸C16：0质量分数显著降低。

图4 添加异丁酸菌体脂肪酸总离子色谱图Fig.4 FAME GC-MS profile of Nonomuraea sp.ATCC 39727 cells grown in medium P150 supplemented with isobutyric acid

2.5 添加3-甲基丁酸对菌体细胞脂肪酸组成的影响

图5为合成培养基P150添加0.3 g/L 3-甲基丁酸后菌体细胞脂肪酸的总离子色谱图。与图1相比，添加3-甲基丁酸后细胞脂肪酸组成变化不大。3-甲基丁酰CoA为奇数碳iso-脂肪酸的合成起始物，添加3-甲基丁酸后i-C15：0脂肪酸质量分数增幅很小(表1)，推测是Nonomuraeasp.ATCC 39727利用3-甲基丁酰CoA为脂肪酸合成起始物的能力较差所致。

图5 添加3-甲基丁酸菌体脂肪酸总离子色谱图Fig.5 FAME GC-MS profile of Nonomuraea sp.ATCC 39727 cells grown in medium P150 supplemented with 3-methylbutyric acid

2.6 添加2-甲基丁酸对菌体细胞脂肪酸组成的影响

图6为合成培养基P150添加0.3 g/L 2-甲基丁酸后菌体细胞脂肪酸的总离子色谱图。2-甲基丁酰CoA为奇数碳anteiso-脂肪酸的合成起始物，但添加2-甲基丁酸却导致a-C17：0脂肪酸质量分数有所降低(表1)，因此Nonomuraeasp.ATCC 39727体内anteiso-脂肪酸的合成还需要进一步的研究。