体细胞核移植技术的研究进展

张鹏

[摘要]体细胞核移植这是近年来人类在细胞生物学及发育生物学领域取得的最伟大的成就之一，他的成功表明动物体细胞的分化是可逆的。然而体细胞核移植的基础理论以及技术研究目前还有很多薄弱点，存在着克隆成功率较低等问题，在一定程度上限制了它的发展。本研究根据近年体细胞核移植技术的研究情况，对应用这项技术进行克隆的主要步骤、该技术在生物学、医学等领域的应用前景以及目前仍需克服的一些问题作一综述。

[关键词]体细胞；核移植；克隆；表观遗传重构

[中图分类号]Q819 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2016）05-40-04

一直以来研究人员普遍认为只有通过卵子和精子相互结合形成受精卵，随着受精卵的不断分化，最终才能发育成为一个新的生命，但在这个过程中，受精卵细胞同时也将逐渐地失去其发育成为完整后代的能力，把受精卵细胞具备发育成为完整个体的能力称为全能性。体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技术的成功归因于人们对细胞全能性的逐步认识。核移植（NT）就是将动物的体细胞或者早期胚胎卵裂球的细胞核，移植进经去核的发育成熟的卵母细胞的胞质中或受精卵中，得到重构的卵母细胞，然后通过重新激活，恢复其细胞分裂及分化，从而促使其发育成为与供体细胞的基因型完全相同的子代，这一技术也可称为体细胞克隆技术。体细胞核移植技术最早是由德国的胚胎学家Spemann 1938年提出的，他起初提出这个理论，主要是为了研究细胞核全能性的机制以及在胚胎发育的过程中细胞质与细胞核的相互作用机理。直到1952年Briggs和King按照他的理论，首次成功地进行核移植试验，他们首先将非洲爪蟾的卵子去除其细胞核，然后向其中移植进其囊胚细胞核，从而得到了正常的后代。随着胚胎工程技术的不断进步，人们先后以不同动物的胚胎细胞等作为供体，不断成功地培育出了各种克隆动物，如克隆羊、克隆牛、克隆猪、克隆小鼠以及克隆家兔等。其中最具有标志意义的是1997年Roslin、研究所的Wilmut等，首次在世界上报道了他们利用体细胞核移植技术，用成熟绵羊的体细胞（乳腺上皮细胞）作为核供体，成功地克隆出“多莉”羊，一下在全世界掀起了轩然大波。这一实验充分证明了高度分化的体细胞仍然具有全能性，人们可以利用体细胞，通过体细胞移植技术获得基因型与供体细胞基因型基本相同的子代个体。成为了生物学以及遗传学发展史上一个重要的里程碑事件。家兔是生物医学研究中最常用的实验动物之一。利用体细胞核移植技术生产克隆兔子是目前研究的热点，在生物医学领域具有十分诱人的应用前景。而家兔被认为是利用体细胞核移植技术难以成功克隆的哺乳动物之一，直到2002年法国学者Patrick Chesne等用卵丘细胞作为核供体首次成功克隆了家兔，突破了家兔难以成功克隆的关键问题，为扩大家兔在生物医学方面的应用研究提供了方法。应用这项技术，2006年我国学者李善刚博士应用成纤维细胞作为核供体成功地培育出克隆家兔，在此基础上他又进一步将转基因技术与体细胞核移植技术结合起来，成功培育出了表达绿色荧光蛋白的克隆兔，将该项技术推向新的高度。

1体细胞核移植的主要方法

具体来讲，体细胞核移植技术主要包括受体细胞的去核、核供体细胞的准备与选择、细胞周期的调控、细胞融合、重组胚胎细胞的激活以及培养等步骤。

1.1受体细胞的选择

在哺乳动物体细胞核移植的实验中，可以作为受体的细胞主要有以下三种：（1）去核的受精卯；（2）去核的MⅡ期成熟卵母细胞；（3）去核的早期胚胎细胞，其中MⅡ期卵母细胞是目前采用较多的核移植受体细胞，因为在这个时期，一方面该细胞体积较大，便于显微操作；另一方面重组胚胎所需要的各种细胞因子在MⅡ卵母细胞质中均存在，而且细胞营养成分充足。在细胞分裂过程中，结合在DNA上的各种细胞因子如转录因子等从DNA螺旋轴上脱离下来，与此同时胞质中的大量重组因子即可与DNA螺旋轴结合，从而促进基因重组的发生。另外一方面，因为选择合适卵龄的卵母细胞作为胞质受体，对体细胞核移植是否能够成功产生巨大的影响，故细胞培养的时间也特别重要，实验中一般多选择培养40～44h，传代4～6代的卵母细胞作为受体细胞。因为大量的实验证明，传代越多重组胚的囊胚率也越多。

1.2受体细胞去核的方法

先要对受体细胞进行去核，才能进行供体核的移植。受体细胞去核必须完全，如果去核不完全，一方面可能导致重组的胚胎细胞染色体形成非整倍体或多倍体从而使克隆直接失败，另一方面也可能使卵母细胞产生异常分裂进而发育受阻甚至可以导致胚胎的早期死亡从而使克隆最终失败。所以是否完全使卵母细胞去核，是保证核移植所形成的新的胚胎细胞能否发育成为正常个体的前提条件。为了减少实验中的干扰因素，可以通过缩短体外操作的时间并快速而准确的去除受体细胞核以避免孤雌发育。大体上受体细胞去核的方法可以分为两种方法，即化学去核法和机械去核法。具体有以下几种操作方法（1）盲吸法：这一方法的优点是不用借助于其他的化学物质，但此法耗费时间较长、易影响细胞质空间结构故对卵母细胞损伤比较严重，所以技术要求较高，不同动物去核率相差也较大，应用较少；（2）半卵法：这个方法是应用特制的卵母细胞切割刀，将卵母细胞切割成为两个半卵，然后丢弃含有极体的那一半半卵细胞，用两个不含极体的半卵细胞与供体细胞核进行融合，构建核移植胚胎。（3）化学试剂去核法：这种方法的原理是利用蔗糖或者脱羰秋水仙碱等化学试剂的作用，使受体细胞能够自行排出第二极体，从而实现去核的目的，但目前还不清楚化学试剂是否对受体细胞造成损伤；（4）挤压法及点压法：此两种方法均是利用固定管固定住细胞，使细胞染色体位于特定位置，然后挤压透明带，用去核针取出第一极体，再用荧光染料Hoechest33342染色后观察其去核率。点压法是挤压法的改进方法，优点是对卵母细胞胞质的损伤较小，在去核操作的过程中不用更换去核针，节省了时间，有效的提高了去核效率；（5）纺锤体探测技术：此法去除细胞核的方法是将卵母细胞放置于Spindle-view偏振光系统的倒置显微镜下，受体卵母细胞的纺锤体区域较其它部位明亮，从而清楚显示其染色体位置，而后再用去核针通过显微镜下操作去核，以利于去核的操作准确完全。（6）透明带膨胀辅助去核法：此法是先用去核针吸入适量操作液后稍施正压，使吸入的操作液平缓流出，推进去核管，使透明带逐渐膨胀，然后用去核针将细胞核取出，此法的优点是缩短了去核操作的时间并且显著地提高了去核操作后卵母细胞的生存率。（7）离心去核法：这个方法的原理是根据细胞质的密度小于细胞核，通过离心的方法将没有透明带的细胞核甩向一侧进而脱离卵母细胞。该方法的缺点是必须去除透明带，不利于之后核移植胚胎的发育。

1.3供体细胞选择与核的移植

实验中可用于核供体的细胞很多，主要有胚胎干细胞（ES细胞）、卵丘细胞、颗粒细胞、睾丸支柱细胞、精子细胞、乳腺细胞、神经细胞以及成纤维细胞等，其中最主要的是两种：一是生殖细胞如卵丘细胞，二是胎儿或成年成纤维细胞。影响核移植成败的一个重要因素是受体与供体细胞的细胞周期同步化发育，早期的研究认为要使体细胞核移植成功必需使供体细胞处于GO期，获得GO期细胞主要是通过两种方法：选择细胞类型或者人工诱导的方法。Inoue等研究人员在小鼠的核移植实验中发现，移植的效率较大的受到供体细胞的细胞类型以及其基因型的影响。近年来许多科研人员通过实验发现把没有经过休眠诱导的处于细胞周期中G1期、G2期以至于M期的细胞作为供体细胞进行核移植也可以获得成功。将供体细胞核移植进入受体细胞的常用方法主要可分为融合法以及注射法两类。其中融合法中目前最常用的是电融合的方法，这是因为电融合的方法具有细胞损害较小、可重复性好而且融合的效果较好等明显的优点，所以逐渐被广大的研究人员所应用。电融合方法的原理是通过细胞在强电场短时间的作用下，使细胞膜产生一过性的击穿，当电流使两个相邻的细胞膜接触的区域发生击穿时，两侧的细胞膜就可以在击穿的瞬间发生接触并融合成为一个细胞。注射法一般分为透明带下注射和胞质内注射。透明带下注射是把整个供核细胞注射至受体细胞卵周隙，这就需要在注射后还需使供体细胞与受体细胞进行融合。胞质内注射一般是用压电一陶瓷微注射系统，直接把供体核注入胞质内。

1.4卵母细胞的激活

因为缺少了受精这一步骤，在以成熟的卵母细胞作为受体的核移植实验中，缺少了自然受精过程中受精卵的激活过程，所以必须进行人工激活核移植后重构的卵母细胞从而促使其进一步分化发育。根据激活时期的不同，可分为移核前激活、移核时激活、移核后激活三种不同的时期。使卵母细胞激活的方法可以分为化学或者物理刺激的方法两类。激活方法目前应用较多的有钙离子载体A23187激活和离子霉素激活、乙醇激活、蛋白质合成抑制剂激活、氯化锶激活、精子提取物激活、蛋白质磷酸化抑制剂激活以及电脉冲激活、联合激活等。虽然卵母细胞可以被以上的各种化学物质以及物理刺激的方法激活，但是却不可避免地在激活的同时也造成受体细胞一定程度的损害，影响胚胎的发育。所以，是否能够尽快地探索出对卵母细胞损伤较小并且激活效率高的激活方法对体细胞核移植技术最终能否成功尤为重要。

2体细胞核移植技术的应用前景

体细胞核移植技术作为细胞生物学及发育生物学领域取得的最伟大的成就之一，应用前景必然是特别广阔的甚至是我们一时无法估量的！其潜在的经济效益是十分巨大的，随着这项技术的不断发展、逐步完善，必将带来生物学以及医学领域的一场深刻变革。这项技术在生物学方面如在保护濒危动植物物种、新物种的培育、优良畜种培育以及转基因动植物生产方面前景十分广阔。另外，这项技术在医疗卫生领域同样具有巨大的应用潜力和发展前景。尤其在医疗卫生领域，可能为机体损伤修复、器官移植乃至遗传性疾病、老年性疾病的治疗等打下坚实的基础，有着不可估量的作用，所以值得科研人员持续关注并为体细胞核移植技术的不断完善发展付出不懈的努力。

3目前存在的问题

自从1997年首次报道体细胞核移植克隆羊获得成功以来，虽然目前科研人员通过体细胞核移植克隆动物已经取得了不少的进展，但是依然存在很多问题，仍缺乏重大突破，比如核移植成功的总体效率仍较低、核移植的胚胎流产率仍然较高以及胚胎发育异常如“巨胎症”等问题，一直困扰着广大的科研人员。有研究人员在实验中发现，在以卵母细胞作为受体的核移植小鼠的重构胚胎中，其中90%的染色体结构是正常的，这就说明这些染色体结构正常的核移植小鼠的基因组应该也是正常的，所以他们推测重构胚胎发育异常绝大部分的原因可能是由于表观遗传重构的错误造成核移植胚胎的异常。表观遗传重构错误主要表现在这几个方面：X染色体失活，基因组印迹，组蛋白乙酰化，DNA甲基化，端粒与端粒酶长度异常等。近些年来，越来越多的体细胞核移植相关实验逐渐证明了核移植中表观遗传重构的错误造成核移植胚胎异常这一理论的正确性。虽然当前核移植技术越来越成熟，但是研究人员对造成这种错误的原因以及其作用的机制仍未完全清楚。各种原因使得核移植的成功率目前仍然较低（<10%），即使胚胎能够正常发育，克隆动物能够出生，但出生后也经常出现各种异常。所以，进一步研究核重构的分子机制，明确已经高度分化的体细胞在卵母细胞中是如何重新去分化的，以及核移植过程中如何发生表观遗传重构等均是急需研究人员不断进行探索的问题。