西藏猫乳总黄酮大孔吸附树脂纯化工艺及其抗氧化活性研究

周忠会 周子琪 索朗欧珠

西藏职业技术学院农业科学技术学院，西藏 拉萨 850025

西藏猫乳(RhamnellagilgiticaMansf. et Melch.)为鼠李科猫乳属植物，主要分布于我国西藏东南部、云南西北部、四川西南部，其茎的干燥木质部可入药，具有燥湿、活血的作用，主治类风湿性关节炎、黄水病和高山多血病等症[1]。研究表明，西藏猫乳中主要含有柚皮素、山萘酚、槲皮素、墨沙酮、花旗松素等黄酮类化合物[2-3]。这些黄酮类化合物多具有抗炎、抗氧化、抗菌等作用，是西藏猫乳的主要活性成分[4]。

目前，西藏猫乳的提取主要采用水提法或醇提法[5]，所得产物杂质较多，纯度较低，有必要寻找一种高效便捷的技术对总黄酮进行纯化。大孔吸附树脂因具有对有机组分的选择性高、机械强度高、价格低廉、再生方便等特点,己广泛用于天然产物的分离纯化[6-7]。但目前还未有大孔树脂纯化西藏猫乳总黄酮的报道。

本研究选用不同型号的大孔吸附树脂分离纯化西藏猫乳总黄酮，通过静态吸附与解吸附及动态吸附与解吸附实验考察其分离纯化工艺[8]，并对抗氧化活性进行评价，旨在为西藏猫乳的进一步开发利用提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂 西藏猫乳(西藏芒康地区，经西藏职业技术学院任军辉副教授鉴定，为鼠李科猫属植物西藏猫乳RhamnellagilgiticaMansf.et Melch)；芦丁标准品(中国生物制品检定所，批号：100080-00707)；HPD-100、D101、AB-8、HPD-750、HPD-200L、HPD-600、ADS-F8、NKA-9型大孔树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)；95%乙醇(国药集团化学试剂有限公司，批号：20180915)、亚硝酸钠(国药集团化学试剂有限公司，批号：20180102)、硝酸铝(国药集团化学试剂有限公司，批号：20180208)、盐酸(国药集团化学试剂有限公司，批号：20180316)、氢氧化钠(国药集团化学试剂有限公司，批号：F20110331)等试剂均为分析纯。

1.2 仪器 HH-4型数显恒温水浴锅(常州天瑞仪器有限公司)；SHA-CA型数显恒温水浴振荡器(常州赛普实验仪器厂)；101-B型数显鼓风干燥箱(上海叶拓仪器仪表有限公司)；N-1110型旋转蒸发仪(上海泉杰仪器有限公司)；SHD-(D)型循环水式多用真空泵(青岛兰特思科教仪器有限设备公司)；HPS-3C型PH测试仪(上海雷磁仪器有限公司)；YP202N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；L7双光束紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 西藏猫乳总黄酮的提取 精密称取西藏猫乳粗粉30.0 g于烧瓶中，加900 mL水加热回流提取2次，每次提取1.5 h，合并提取液，置于旋转蒸发仪浓缩至100 mL，置于烧杯中，得到西藏猫乳提取液,4 ℃储藏备用。

2.2 西藏猫乳总黄酮的纯度测定

2.2.1 芦丁标准曲线的绘制 精密称取芦丁对照品0.0320 g，用60%乙醇溶解，定容于100 mL的容量瓶,摇匀后得到芦丁标准溶液。准确吸取标准液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL的量瓶中，分别加入60%乙醇使至5.0 mL,再分别加入5%的NaNO2溶液0.3 mL,摇匀，静置6 min后加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min后加入4% NaOH溶液10.0 mL，最后用体积分数为60%乙醇定容至25 mL，静置15 min。以空白液为对照品，使用紫外分光光度计于510 nm波长处测量其吸光度。以芦丁标准品溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，进行线性回归，得到标准曲线方程y=9.0811x+0.0701(R2= 0.9999)，线性范围为0～0.1 mg/mL。

2.2.2 精密度 精密移取芦丁对照品溶液2 mL，按2.2.1项下方法，同法测定吸光度，重复测定6次，记录吸光度值。计算RSD值,结果显示 RSD=0.78%，表明该方法、仪器的精密度较好。

表1 精密度实验结果

2.2.3 稳定性 取同一西藏猫乳提取液1 mL，按2.2.1项下方法，每隔10 min同法测定1次吸光度，记录120 min内提取液的吸光度值。结果表明该供试品溶液在120 min内保持稳定，RSD值为0.44%。

2.2.4 重复性 取同一批供试品西藏猫乳粗粉6份，每份约30 g，精密称定，按2.1项下方法制备提取液，分别精密移取提取液1 mL，按2.2.1项下方法，同法测定，记录吸光度值。结果显示RSD=1.18%,表明该测定方法重复性较好。

表2 稳定性实验结果

表3 重复性实验结果

2.2.5 加样回收实验 取已测总黄酮含量的西藏猫乳粗粉6份，每份约15 g，精密称定，分别精密加入30.0 mg芦丁标准品，按“2.1”项下方法处理，于510 nm处测定，计算回收率。得到平均回收率为99.78%,RSD值为0.40%,结果表明此法回收率良好。

表4 加样回收实验结果

2.2.2 西藏猫乳提取液中总黄酮浓度的测定 取适量西藏猫乳提取液按标准曲线测定方法操作，显色后在510 nm波长处测定其吸光度，代入标准曲线方程计算样液中黄酮的质量浓度,得到西藏猫乳提取液中总黄酮浓度为0.6 mg/mL。

2.3 大孔吸附树脂纯化西藏猫乳总黄酮

2.3.1 大孔吸附树脂的预处理 将8种树脂(HPD-100、D101、AB-8、HPD-750、HPD-200L、HPD-600、ADS-F8、NKA-9)用95%乙醇浸泡24 h，使其充分溶胀，倾倒上层悬浮颗粒和乙醇，再使用蒸馏水洗至树脂无醇味，保存备用[9]。

2.3.2 大孔吸附树脂的选择 准确称取处理好的8种树脂各2.0 g于100 mL具塞锥形瓶中，分别加入50 mL黄酮浓度为0.6 mg/mL的西藏猫乳提取液，恒温恒速振荡吸附24 h，取上清液，测定上清液总黄酮浓度，并按式①分别计算8种树脂对黄酮的吸附率。将吸附饱和的树脂过滤后，用去离子水洗至洗涤液无色，分别加入75%乙醇20 mL，恒温恒速振荡解吸附24 h，取上清液，测定上清液总黄酮浓度，并按式②分别计算8种树脂的洗脱率[10]。

①

②

式中，C0为样液黄酮初始质量浓度(mg/mL);C1为吸附饱和后样液黄酮质量浓度(mg/mL);C2为解吸液黄酮质量浓度(mg/mL);V1为吸附液体积(mL);V2为解吸液体积(mL) 。

8种大孔树脂对西藏猫乳总黄酮的静态吸附和解吸能力有所不同，这与大孔树脂的极性、平均孔径和比表面积有关[11]。结果如图2所示，其中ADS-F8型树脂对总黄酮的吸附率为94.56%、解吸附率为84.64%，吸附与解吸附效果优于其他七种树脂，这是由于ADS-F8型树脂极性与西藏猫乳中黄酮类化合物极性较为接近，故选用ADS-F8型树脂分离纯化西藏猫乳。

2.3.3 大孔吸附树脂纯化西藏猫乳总黄酮工艺优选

2.3.3.1 样液pH对树脂吸附率的影响 准确量取6份西藏猫乳提取液各50 mL置于烧杯中，用0.1 mol/mL盐酸溶液调节至pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的样液。称取6份预处理后的ADS-F8树脂置于具塞锥形瓶中，分别加入不同pH值样液，于25 ℃、120 r/min振荡吸附24 h，吸附饱和后，取上清液测定其总黄酮浓度，计算树脂吸附率。

由图3可知，在酸性条件下树脂吸附率较高，当样液pH为3.0时，吸附率最大，这可能是因为黄酮具有酚羟基结构，在酸性条件下以分子状态存在，有利于大孔树脂与黄酮之间进行物理吸附，但黄酮一般显弱酸性，在样液pH值太低的情况下，样液中的部分黄酮会析出，导致树脂的吸附率降低[12]，因此在样液pH值为2时树脂的吸附率低于pH值为3时，而随着碱性增强，黄酮易解离成酸根离子，吸附作用降低[13]。因此，选择样液的最佳pH值为3.0。

2.3.3.2 样液浓度对树脂吸附率的影响 取等体积、总黄酮浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的西藏猫乳提取液，调节pH至2～3，准确称取6份预处理后的ADS-F8树脂各2.0 g置于具塞锥形瓶中，分别加入配置的不同浓度样液，振荡吸附24 h，吸附饱和后，取上清液测定其总黄酮浓度，计算树脂吸附率。

由图4可知，随着上样浓度的增大，吸附率先增大后减小，当浓度为0.6 mg/mL时，吸附率达到最大值，并随着浓度的进一步增加而略有降低，这是因为随着样液浓度增加，与大孔树脂单位表面积接触的黄酮越多，吸附效果越好[14]；但样液浓度过高，杂质含量也增加，树脂容易堵塞[15]，考虑到实验效率的问题，故选择上样浓度为0.6 mg/mL。

2.3.3.3 洗脱液浓度对解析率的影响 准确称取预处理后的ADS-F8树脂置锥形瓶中，分别加入总黄酮浓度为0.6 mg/mL、pH为2～3的西藏猫乳提取液50 mL,振荡吸附24 h，吸附饱和后，取上清液测定其总黄酮浓度。将吸附饱和的树脂过滤后，洗涤，分别加入50 mL浓度为50%～90%的乙醇，振荡解吸附，测定洗脱液总黄酮浓度，计算树脂解吸附率[16]。

由图5可知，随着乙醇浓度的增加，解吸率升高，当浓度达到60%时，解吸率达到最大值，浓度继续增加，解吸率反而降低。原因可能是西藏猫乳总黄酮在60%乙醇中溶解度达到最高，吸附在树脂上的黄酮更容易解吸下来，但是乙醇体积分数过高，使大量醇溶性杂质也随之洗脱下来，反而导致洗脱率降低。因此，选择60%乙醇溶液作为最佳洗脱剂。

2.3.3.4 上样液体积对树脂吸附作用的影响 准确称取ADS-F8树脂各2.0 g，湿法装柱(柱体积为50 mL)。取总黄酮浓度为0.6 mg/ mL、pH为3.0的西藏猫乳提取液以1 mL/min的流速上样，收集流出液，每1 BV为一个收集段,共收集28 BV，测定每段收集液中黄酮的质量浓度，绘制动态泄露曲线[17]。

由图6可知，当收集到第23份流出液时，流出液中总黄酮开始出现大量的泄漏，一般情况下，流出液的目标物质量浓度为上样液目标物质量浓度1/10时，认为达到了目标物的泄漏点[18]，由图可看出泄露点为23 BV左右，基于节约原料的原则，选择上样量为23 BV。

去年以来，西江广东段没有发生重特大水上交通安全事故，水上安全事故下降八成；成功救助遇险人员152人，搜救成功率99.25%，船舶违章行为明显减少；西江岸线整治取得突破性进展，仅在肇庆段就清理取缔非法码头、临时装卸点119个，打掉一大批非法采砂点；经过沿线六市政府积极协作，西江沿岸投入建设了7个应急设备库、13个溢油应急物资储备点、4个防污应急服务点、3个拖轮值守点，水上应急能力和水污染防治能力进一步加强……

2.3.3.5 洗脱剂用量对解析率的影响 准确称取预处理后的ADS-F8树脂2.0 g，湿法装柱，取总黄酮浓度为0.6 mg/mL、pH为3.0的西藏猫乳提取液上样50 mL,吸附饱和后，用蒸馏水洗至洗脱液无色，将浓度为60%的乙醇分为50%、60%、70%、80%、90%的体积分数进行洗脱，每1 BV为1个收集段，共收集30 BV，测定每段洗脱液中总黄酮的质量浓度，绘制动态解吸曲线。

由图7可知，在开始的2 BV，洗脱液中总黄酮质量浓度快速增加，在洗脱体积为2 BV时达到最大值，洗脱体积为2～8 BV时，总黄酮质量浓度逐渐减少，当洗脱体积为8 BV时，洗脱液中总黄酮浓度趋于0,说明洗脱已基本完全。因此，选择8 BV作为最佳洗脱体积。

2.3.4 工艺验证 取树脂ADS-F8树脂3份，采用确定的最佳工艺条件分离纯化西藏猫乳总黄酮。对洗脱液进行干燥、称重，验证干燥物中总黄酮浓度。

选取ADS-F8型大孔吸附树脂，取总黄酮浓度为0.6 mg/ mL、pH为3.0的西藏猫乳总黄酮提取液以适当流速上样23 BV，用蒸馏水洗至洗脱液无色，60%乙醇以适当流速洗脱，洗脱体积为8 BV。结果表明，经过纯化后，样品总黄酮浓度可由原来的17.13%上升至24.67%，精制倍数为1.44。表明此工艺条件适用于西藏猫乳总黄酮的分离纯化，且稳定可行。

表5 工艺验证实验结果

2.4 西藏猫乳总黄酮体外抗氧化研究

2.4.1 清除DPPH自由基能力 在96孔酶标板中，依次加入不同体积(30～100 μL)西藏猫乳生药浓度为2 mg/mL的样品溶液和200 μL浓度为1 mmoL/L的DPPH甲醇溶液，最后用甲醇补齐至总体积300 μL。室温避光反应30 min，酶标仪测定其吸光度A1，以甲醇代替DPPH溶液测得吸光度A2，以甲醇代替样品溶液测得空白吸光度A0。以维生素C作为阳性对照，每一浓度做3个平行样品，取平均值[19]。清除DPPH自由基能力按下式计算：

由图8可知，维生素C的抗氧化活性最强。西藏猫乳提取液在不同浓度下的自由基清除率均低于纯化后西藏猫乳总黄酮，清除率稳定后仍不足60%，IC50值为1.23 mg/mL。纯化后西藏猫乳总黄酮的DPPH自由基清除率随着浓度的增加而逐渐上升，且在浓度达到1.6 mg/mL后趋于稳定，此时清除率达到了65%以上，呈现出良好的清除效果。IC50值略低于纯化前，为1.21 mg/mL。

由图9可知，纯化后的西藏猫乳总黄酮ABTS自由基抑制率在0.5～5 mg/mL浓度范围内逐渐升高，在浓度为5 mg/mL时其清除率达到99.15 %，接近于维生素C水平，并高于西藏猫乳提取液，表现出良好的抗氧化活性。纯化后的西藏猫乳总黄酮对ABTS自由基清除率的IC50值为1.13 mg/mL，低于纯化前1.51 mg/mL,说明纯化后西藏猫乳总黄酮抗氧化活性相比于纯化前得到了提升。

2.4.3 FRAP法测定还原能力 将FeSO4溶液，与 TPTZ溶液和醋酸盐缓冲液混合，吸取该混合液加入96孔板中，酶标仪于593 nm读取吸光值。以FeSO4溶液的浓度为横坐标，吸光值(A)为纵坐标，进行线性回归，得到标准曲线曲线方程为y=1.7963x+0.0209(R2=0.9996)[21]，线性范围为0～0.16 mmoL/L。

纯化后西藏猫乳总黄酮配置成系列浓度样品，20 mmoL/L FeCl3·6H2O溶液、10 mmoL/L TPTZ溶液和醋酸盐缓冲液按照1∶1∶10的比例混合后，酶标仪于593 nm处读取吸光值A1，在孔中加入20 μL不同浓度的样品，8 min后于593 nm处读取吸光值A2，A2-A1的差值在标准曲线上获得与样品的还原力相当的FeSO4的浓度(μmoL/L)，定义为FRAP(Ferric Ion Reducing Antioxidant Power)值。按照上述实验步骤，计算相同浓度维生素C的FRAP值，每一浓度做3个平行样品，取平均值。

由图10可知，纯化后西藏猫乳总黄酮的Fe3+还原能力强于西藏猫乳提取液，当生药浓度到达6 mg/mL时，还原能力趋于平稳，浓度为10 mg/mL时，有最大还原能力，FRAP值为939.8 μmoL/L。

3 结论

大孔吸附树脂分离纯化技术具有操作方便、分离效果好、再生方便、经济成本较低一系列优点，广泛应用于皂苷、生物碱和黄酮成分的分离纯化[22]。由于不同型号大孔吸附树脂的极性、孔径、比表面积等不同，其分离性质也会有较大差异[23]，故在本研究中，通过对所选8种树脂进行静态吸附与解吸附实验，筛选出ADS-F8树脂为分离纯化西藏猫乳总黄酮的最佳树脂，并通过单因素考察，最佳纯化工艺条件为：样液浓度0.6 mg/mL, pH值3.0，上样体积23 BV，洗脱剂为60%的乙醇，洗脱体积8 BV。采用该纯化工艺，所得总黄酮的浓度可提高至24.67%。

此次研究考察了纯化后西藏猫乳总黄酮对DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力，同时通过FRAP法测定其还原能力。在自由基清除实验中，纯化后总黄酮DPPH 自由基清除率大于65%，清除率相对于提取液有一定提升，纯化后西藏猫乳总黄酮IC50值为1.21 mg/mL，比纯化前有所降低，说明纯化后总黄酮对DPPH自由基拥有更好的清除活性；在ABTS实验中，纯化后总黄酮IC50值为1.13 mg/ mL，低于西藏猫乳提取液，表明纯化后总黄酮的自由基清除率高于西藏猫乳提取液。FRAP法即Fe3还原法，Fe3+还原法是应用较广泛的抗氧化能力评价方法，可间接评价样品的抗氧化活性，此次研究中，纯化后总黄酮的Fe3+还原能力高于西藏猫乳提取液，证明纯化后总黄酮抗氧化能力更显著。上述抗氧化实验结果说明，纯化后西藏猫乳总黄酮具有良好的抗氧化能力，且抗氧化能力优于西藏猫乳提取液。

综上，此次研究确定了西藏猫乳总黄酮分离纯化相关工艺条件，并且发现纯化后的西藏猫乳总黄酮具备良好的抗氧化活性，这为西藏猫乳进一步的研究与开发提供了实验依据。