比色法辅助下紫外分光光度法测定芦山藤总黄酮含量

陈惠媚 黄 颖 刘梦君 吴鸿羽 张倚玮 黎蔚玲

广西中医药大学赛恩斯新医药学院，广西 南宁 530000

芦山藤是菊科植物岩穴千里光Cissamp-elopsisspelaeicola(Vant)C.Jeffrey et Y.L.Chen的干燥茎叶，具有活血、止痛、祛风除湿等功效，用于治疗跌打损伤、风湿骨痛、小儿惊风等症[1]。早记载于《中国高等植物图鉴》。而在《贵州植物志》中记载的芦山藤别名为岩生藤菊。产于四川、贵州、云南、广西[2]。据前期的瑶药调查发现，芦山藤除了友谊关分布外，广西壮族自治区金秀瑶族自治县的大多数地方也有分布。但是通过查阅国内外文献，发现瑶药芦山藤的化学成分、药理活性、质量控制等方面的相关报道、研究较少。梁爽等[3]从糯米风75%乙醇提取物中共分离鉴定出12个化合物。为了进一步研究芦山藤的化学成分，本实验利用已有的测定总黄酮方法，如陈凌霆等[4]采用超声辅助显色测定黄芪总黄酮含量对广西瑶药芦山藤的总黄酮含量测定进行研究。现报告如下。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 SHIMADZU电子天平(AUY220)；紫外分光光度仪(北京普析通用仪器有限公司-TU-1901)；昆山市超声仪器有限公司(KQ5200DE型数控超声波清洗器)。

1.2 药品 芦丁标准品购买于上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：5981；药材及鉴定芦山藤：2019年购于广西金秀县，经广西中医药大学壮医药学院韦松基教授鉴定为菊科植物岩穴千里光Cissampelopsisspelaeicola(Vant)C.Jeffrey et Y.L.Chen的干燥茎叶。实验室常用药品，试剂，本实验中所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 提取总黄酮 准确称取被粉碎芦山藤2.000 g后于干燥锥形瓶中用70%乙醇(料液比1∶30)，60 ℃温度下超声提取30 min，超声辅助乙醇提取法冷却过滤，制得供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取芦丁标准品10 mg，放入容量瓶(100 mL)中，加70%乙醇溶解后定容，即配成芦丁标准溶液(0.1 mg/mL)，放入冰箱备用。

2.3 确定最大吸收波长 显色剂(5%NaNO3-8%Al(NO3)3-5%NaOH)显色，显色时间参考李敏等[5]研究，在空白组对照下，测得供试品溶液的最大吸收波长，在360～700 nm范围内最大吸收波长为406 nm。如图1所示。

2.4 标准曲线的制备 分别精密量取标准溶液3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0 mL，置于容量瓶(25 mL)，用70%乙醇稀释至25 mL，加1.00 mLNaNO2溶液(5%)，摇匀，放置6 min，加入8%Al(NO3)3溶液1.00 mL，摇匀，放置6 min，再加入10 mL 5%NaOH溶液，用70%乙醇定容，放置15 min用 0.0 mL标准溶液组作为空白对照组，在406 nm波长中测定其吸光度，并绘制标准曲线如图2所示，结果表明芦丁在18.4～53.6 μg/mL范围内有良好的线性关系。A=0.01288C+0.01587，r=0.9998。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密性实验的测定 精确量取上述供试品溶液2 mL，参照“2.4”项显色及测定吸光度的方法制备，连续测定5次，RSD为0.90(n=5)，结果表明，该方法具有良好的精密度见表1。

表1 精密性实验结果

2.5.2 重现性实验 取同一批芦山藤药材，按照供试品溶液制备的方法制备5份供试品溶液，各取2 mL，并按照“2.4”项的显色方法制备后测定其吸光度，计算测得总黄酮的平均含量为13.48 mg/g，RSD为1.75，实验结果说明该方法的重复性良好。见表2。

表2 重现性实验结果

2.5.3 稳定性实验的测定 在室温条件下，精确吸取供试品溶液1 mL并参照“2.4”项的方法制备显色后测定其吸光度，分别在有光和无光的条件下，静置不同时间后分别测定吸光度，结果见表3、表4。

表3 光线条件下稳定性的测定

表4 无光条件下稳定性的测定

由表3、表4可见，在有光和无光的条件下RSD(%)分别为2.4和2.85，结果表明该实验在室温条件中40 min内具有良好的稳定性。

2.5.4 加样回收率 实验精密吸取已知含量的芦山藤供试品溶液6份，每份1 mL分别添加0.1 mg/mL芦丁对照品溶液4 mL按照“2.4”项的方法制备，显色后测定其吸光度，并计算回收率。试验结果平均回收率为99.0%，RSD为2.50%，表明该方法具有良好的回收率。见表5。

表5 加样回收率实验结果

2.6 样品含量的测定 准确称取芦山藤药材粉末1 g，将这药材分成3组，配制成供试品溶液按照“2.4”的显色方法制备成供试品溶液：各精密量取2 mL上述制备成的供试溶液置于容量瓶(25 mL)中，加70%乙醇定容，加入显色剂按(5%Na- NO2-8% Al(NO3)-5%NaOH)，在406 nm的波长下测定吸光度，并计算出芦山藤总黄酮的含量。见表6。

表6 样品含量测定结果

根据整个实验结果数据分析表明，在显色条件为5%NaNO2-8%Al(NO3)3-5%NaOH下，得广西金秀县芦山藤总黄酮的平均含量为1.28%，实验回收率为99.0%。实验中精密度，重现性以及加样回收率的RSD分别为0.90、1.75、2.50，稳定性在有光和无光下的RSD为2.40、2.85都符合要求。

3 讨论

瑶药种类繁多，但是目前对瑶药研究以及开发利用相对较少，而芦山藤的研究更是缺乏，梁爽等[3]从糯米风75%乙醇提取物中共分离鉴定出12个化合物，主要为萜类、酚酸类、黄酮类等，其成分及药理作用的研究尚未见相关报道。本实验主要对芦山藤的总黄酮进行含量测定；而总黄酮具有较多功效和作用，李磊等[6]研究表明黄芩总黄酮具有显著的降血脂作用；对缺血再灌注损伤的保护作用, 如纪影实等[7]研究表明山楂叶总黄酮能够降低细胞膜的损伤,具有膜稳定性的作用，其能够提高机体清除自由基的能力,而且能显著降低血清中的肌酸激酶以及乳酸脱氢酶的活性。其还具有抗炎作用，柴玲等[8]研究表明拟草果可显著下调炎症因子IL-6的表达。所以该实验的研究不但能够促进瑶药的发展，而且能促进芦山藤在降血脂、抗炎等方面开发和利用。本实验在已有的测定总黄酮实验的条件下测定吸光度，其最大吸收波长为406 nm，线性方程为A=0.01288C+0.01587，总黄酮的回收率为99.0%，相对偏差RSD为2.50。实验表明，该方法重复性、稳定性、回收率、精密度均符合含量测定要求，操作简单，结果可靠。该研究可以为芦山藤开发与利用提供进一步的理论依据。