柴葛畅原合剂中葛根素的含量测定

查 鑫 阮婧华 范东生 苏松柏 夏 青 辛加敏 汤 谨 万明香

贵州中医药大学第一附属医院，贵州 贵阳 550001

医院制剂“柴葛畅原合剂”由陶氏柴葛解肌汤合藿香正气散加减化裁而成[1],用于感冒风寒、郁而化热证。处方由葛根、柴胡、穿心莲等十四味药组成。葛根为君药，解肌清热、生津止渴[2]；现代药理学研究表明葛根主要药效成分葛根素，具有抗炎、抗氧化等多种功能活性[3-5]，为葛根制剂的主要质量控制指标[6-7]。目前医院制剂柴葛畅原合剂相关质量标准尚无含量检测，难以保证该制剂的质量稳定性。本试验采用HPLC法建立柴葛畅原合剂中葛根素的含量测定方法，以期完善柴葛畅原合剂的质量标准。该操作简单、专属性高、灵敏高、重复程度强，能够应用于该制剂的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪(waters E2695,美国waters公司)，二极管阵列紫外检测器(Waters 2998，美国waters公司)；MS105DU天平(梅特勒-托和多仪器有限公司)。

1.2 试药 柴葛畅原合剂(实验室自制，批号20200301、20200302和20200303)；葛根素对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110752-201615)；甲醇为色谱纯(美国TEDIA公司)；实验用水是实验室超滤设备MILLI-Q IQ 7000的过滤水；乙醇为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 CAPCELL PAK C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 um)，流动相A为甲醇，B使用甲酸，其比例为30∶70，温度控制在25 ℃，流速需达到1.0 mL/min，其波长250 nm，体积为10 uL。该物质和其他色谱峰分离程度达到需要，时间共需要12 min，计算该物质峰理论塔板数不低于4000。

2.2 溶液的制备 对照品溶液设置: 精准称量对照品5.4 mg，采用浓度为30%乙醇进行稀释定容至20 mL容量瓶中，最终浓度为0.27 mg/mL。从上述储备液中取1 mL至10 mL的量瓶，30%乙醇定容，得浓度 0.027 mg/mL对照品溶液，4℃环境中储存。

供试品溶液制作: 精准吸取供试品1 mL至20 mL容量瓶中，30%乙醇定容，混匀，过0.22 μm滤膜，得供试品溶液。

阴性空白对照溶液: 按照相应的比例以及相关的工艺制作阴性该物质样品，并依照相关的手段制作阴性空白对照。

2.3 专属性试验 使用“2.2”中的对照品、供试品和阴性对照溶液，照“2. 1”项下检测，对其结果进行记录。结果表明阴性对照不影响该物质的测定。色谱图如图 1所示。

2.4 线性关系考察 精密吸取葛根素对照品溶液 2.5 μL，5 μL，7.5 μL，10 μL，12.5 μL，15 μL，按“2. 1”项下色谱条件进行检测。以检测物质的进样量(μg)作为横轴(X)，峰面积为纵轴(Y)制作曲线，得到方程Y=4068.4X-84688(r2=0.9999)。其数据显示，该物质在0.0675 ～ 0.4050 μg和峰面积线性关系达到预期。

2.5 精密度试验 使用“2.4”项下的对照品溶液，依照“2.1”项下色谱环境下，对其进行分析并对其数据处理，重复6次操作，峰面积进行详细的记录。结果该物质的峰面积达到RSD为0.52%(n=6)，证明仪器的精密程度可以进行试验。

2.6 稳定性试验 取供试品溶液(批号202003 01)，在0、2、4、8、12、24 h，依照“2.1”项下色谱环境下，对其进行分析并对其数据处理，峰面积进行详细的记录。结果表明，该物质的峰面积达到RSD为1. 7% (n=6)，通过这一结果可以表明溶液在1日内稳定性较好。

2.7 重复性试验 取相同的6份样品( 批号20200301) ，按“2.2”项下制备供试品溶液，依照“2.1”项下色谱环境下进行分析并对其数据处理，检测其含量。结果表明该物质的平均含量达到0.3217 mg/mL，RSD为1.9%(n=6)，证实该种方式能够进行重复测量。

2.8 加样回收试验 取已经知道含量的同一批样品(批号：20200301，样品中葛根素含量为0.32 mg/mL)，精准吸取规定体积样品6份，精准加入质量为0.1601 mg葛根素对照品，按“2.2”项下制备相应的供试品溶液，依照“2.1”项下色谱环境下进行分析并对其数据处理，算出回收率。见表1。

表1 加样回收率试验 (n=6)

2.9 样品测定 取3批柴葛畅原合剂样品，按“2.2”项下制作相应的供试品溶液，依照“2.1”项下色谱环境下进行分析并对其数据处理，分别进样检测，计算该物质的含量。见表2。

表2 样品含量测定结果 (n=3)

3 讨论

3.1 色谱条件优化 柴葛畅原合剂作为本院的院内制剂之一，临床疗效良好、市场需求较大，质量标准低，已不适应中医药的现代化，因此本研究参照2015年版《中国药典》第一部“葛根”项下含量测定方法，采用HPLC色谱法来测定柴葛畅原合剂中葛根素的含量。医院制剂柴葛畅原合剂的君药葛根中葛根素的含量测定进行HPLC测定，选择检测波长为250 nm，尝试流动相为甲醇-水(25∶75)[8-9]、流速为1.0 mL/min等色谱条件，测定柴葛畅原合剂中葛根素的含量，其色谱峰保留时间较长，并没有达到最佳分离效果。为达到最佳分离效果，相应地调整了色谱条件，流动相选用0.1%甲酸-甲醇(30∶70)，流速1.0 mL/min，葛根素峰保留时间为12 min左右,分离效果好，峰型理想。

3.2 样品处理优化 试验中曾用样品挥干后加30%乙醇定容至20 mL加热回流半小时，过滤，取续滤液作为供试品，结果显示，其峰面积和笔者所用的样品处理方法峰面积相差不大，考虑到其简单，好操作的特点，故笔者采取了“2.1”项下的样品处理方法，此方法简便，重复性，专属性良好，特别适合医院制剂室利用现有的设备条件进行中药制剂生产，控制质量。

4 结论

医院中药制剂是指市场上不存在但临床上必需且已获准生产的制剂类型。它们中的大多数是根据秘密秘方，处方或医院处方开发的。常用的剂型有合剂，糖浆剂，颗粒剂和胶囊剂等，因为其疗效肯定且受患者喜欢。近年来，很多新药取缔了院内制剂，并投入了使用。除此之外，药品监督管理部门增加了监督管理力度，医院对中药制剂的压力也逐渐增加[10-12]。怎样提高制剂品质，开发可靠，放心，并且有治疗效果的制剂，已成为中医医院发展过程中需考虑的关键，也是该领域相关人员需解决的任务[13-14]。笔者以医院制剂柴葛畅原合剂为研究对象，以葛根素做为柴葛畅原合剂中含量测定的指标，建立了高效液相测定其葛根素含量测定的方法。该方法操作简单、专属程度大、灵敏特异性高、重复性强，可以在该制剂的质量控制阶段使用。