用于选择性识别Fe3+和Cr3+的罗丹明6G 荧光探针

谷 浩，唐黄昊，弟江一，陆颖欣，刘 凯，2，朱柏林，2

（1.天津师范大学化学学院，天津300387；2.天津师范大学天津市功能分子结构与性能重点实验室，天津300387）

随着小分子荧光化合物在化学传感、共聚焦显微镜和有机发光二极管等多领域应用的日益广泛，近年来关于小分子荧光化合物的研究备受关注[1-4]．由于阳离子在生物和环境中的作用极其重要，因此构建识别性能优异的阳离子荧光探针具有重要的应用价值．众多阳离子中，Fe3+在生物体运输氧、DNA/RNA 合成及酶催化等过程中起到不可缺少的作用[5-6]，而环境污染物Cr3+对哺乳动物体内蛋白质、碳水化合物和核酸的新陈代谢亦有重要影响[7-8]．目前用于Fe3+和Cr3+检测的荧光探针已见报道，但此类化合物多涉及复杂的有机合成，且多为“turn-off”型荧光探针[9-16]，易受环境影响，其应用范围受到限制．因此，设计灵敏度高、不易受环境影响的“turn-on”型Fe3+和Cr3+荧光探针具有重要意义．

罗丹明类化合物具有优良的光化学和光物理性能[14-21]，其内酰胺的螺环结构在金属离子或小分子客体作用下，存在“关-开”结构互变，导致此类化合物发生荧光“Off-On”转化．自Czarnik 课题组首次报道了基于罗丹明内酰胺螺环结构的Cu2+荧光探针[22]之后，众多科研团队据此构建了多种基于罗丹明的阳离子荧光探针[16-21，23-30]，其中，多数探针是通过罗丹明6G 酰肼（rhodamine 6G hydrazine，RH）与相应醛或酮的缩合反应[17-21，24-31]制备而成，其结构简单、易于制备且同样具有“关-开”结构互变.罗丹明6G 酰肼的阳离子识别性能鲜见报道．本研究利用罗丹明6G 酰肼内酰胺螺环结构的转变，实现了对Fe3+和Cr3+的选择性“turn-on”荧光识别．

1 实验

1.1 仪器与试剂

仪器：F-6000 荧光光谱仪，日本日立公司．

试剂：罗丹明6G、水合肼和醋酸酐均为分析纯，上海阿拉丁生化科技有限公司；无水乙醇为光谱纯，上海阿拉丁生化科技有限公司；硝酸盐（Na+、Mg2+、Ba2+、Sr2+、Hg2+、Pb2+、Cd2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Cr3+和Fe3+）为分析纯，上海才锐化工科技有限公司．

1.2 主体化合物制备

氩气保护下，称取罗丹明6G（2.0 g，4.67 mmol）置于圆底烧瓶中，加入适量无水乙醇，滴加水合肼（0.40 g，9.33 mmol），回流4 h，乙醇重结晶得到白色固体（罗丹明6G 酰肼），产率为50%.1HNMR（400 MHz，CDCl3）δ：8.01 ～7.91（m，1H），7.50 ～7.41（m，2H），7.10 ～7.02（m，1H），6.48 ～6.34（s，2H），6.32 ～6.17（m，2H），3.64 ～3.50（s，3H），3.27 ～3.17（q，4H），1.98 ～1.86（s，6H），1.37 ～1.28（t，6H）；ESI-MS：429.2297（[M+H+]）．

1.3 方法

1.3.1 RH 的阳离子选择研究

溶液配制：配制10 μmol/L 主体罗丹明6G 酰肼乙醇溶液作为储备液，用于主体阳离子识别性能的研究．用亚沸水溶解适量硝酸盐（Na+、Mg2+、Ba2+、Sr2+、Hg2+、Pb2+、Cd2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Cr3+和Fe3+），作为储备液，用于主客体相互作用研究．

在pH 值=5.5 条件下，固定主体浓度为10 μmol/L，加入客体阳离子（浓度均为100 μmol/L），测量荧光光谱，扫描波长范围为500～700 nm．

1.3.2 pH 值对RH 及RH 与金属离子相互作用的影响

固定主体浓度为10 μmol/L，加入不同pH 值的Tris-HCl 缓冲液，测试其荧光光谱.在不同pH 值的Tris-HCl缓冲液中，固定主体浓度为10 μmol/L、客体浓度为100 μmol/L，进行荧光光谱测定．通过比较荧光强度变化，确定RH 与金属离子相互作用的最佳pH 值．

1.3.3 利用荧光滴定技术研究RH 与Fe3+和Cr3+的相互作用方式

在pH 值=5.5 条件下，固定主体浓度为10 μmol/L，改变Fe3+浓度（1.0 ～800.0 μmol/L）和Cr3+浓度（1.0 ～1 000.0 μmol/L），分别测试其荧光光谱，研究主客体相互作用方式．

主客体相互作用的平衡常数通过非线性最小二乘法公式进行拟合[32-33]．

式中：A 为荧光强度；K 为主客体相互作用平衡常数；[H]和[G]分别为主客体的浓度；P 为相关参数．

2 结果与分析

2.1 RH 阳离子的选择性

探针RH（10 μmol/L，V乙醇∶VTris-HCl缓冲溶液=1 ∶9，pH值=5.5）与阳离子相互作用的荧光光谱如图1 所示．

图1 探针RH 与阳离子相互作用的荧光光谱Fig.1 Fluorescent spectrum of RH in presence of different cations

由图1 可以看出，RH 经530 nm 激发后，在554 nm处有弱的荧光信号，表明RH 主要以内酰胺螺环结构存在[2，15-17，19，21]．向RH 体系中加入300.0 μmol/L 的Cr3+或Fe3+后，主体体系发生明显的颜色变化（由无色变为粉红色），同时荧光强度明显增强，且Fe3+引起主体荧光增强的程度大于Cr3+． 这是因为Fe3+和Cr3+均能够诱导RH 内酰胺螺环开环，形成了杂蒽环π 键体系，并与阳离子配位，导致主体荧光光谱明显改变[16，22，26-27，32]．300.0 μmol/L Cu2+的加入也引起了探针RH 荧光强度增强，但程度较弱，这可能是Cu2+诱导RH 开环后发生水解造成的结果[29]．相同条件下其他阳离子未能引起探针RH 明显的光谱变化，表明探针RH 能够特异性地识别Fe3+和Cr3+．

为进一步证实探针RH 对Fe3+和Cr3+的选择性识别，考察Fe3+和Cr3+与其他阳离子（Na+、Mg2+、Ba2+、Sr2+、Hg2+、Pb2+、Cd2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+） 共存时RH-Fe3+和RH-Cr3+的荧光光谱，结果如图2 所示．

图2 阳离子对探针RH 与Fe3+和Cr3+荧光强度的影响Fig.2 Influence of other cations on the fluorescence intensity of RH-Fe3+and RH-Cr3+

由图2 可以看出，其他阳离子的加入均未引起RH-Fe3+和RH-Cr3+荧光强度的明显变化，但Fe3+的存在导致RH-Cr3+荧光强度增加．这可能是因为Fe3+与RH具有更强的键合能力，取代Cr3+与RH 结合所致．竞争实验结果表明，探针RH 可特异性地识别Fe3+和Cr3+．

2.2 pH 值对RH-Fe3+和RH-Cr3+的影响

罗丹明类化合物的内酰胺螺环结构除受金属离子诱导开环外，其稳定性也受到测试体系pH 值的影响[24，29-31]．pH 值对RH 和RH-Fe3+共存体系影响的测试结果如图3 所示．

图3 pH 值对RH 及其与Fe3+共存体系的影响Fig.3 Effect of pH value on the fluorescence of RH and RH-Fe3+，respectively

由图3 可以看出，体系pH 值较低时RH 的荧光强度较高，这是因为H+浓度较高会引发罗丹明内酰胺螺环开环[34]． 体系pH 值为3～10 时，RH 荧光强度较小且基本不受pH 值变化的影响，表明此pH 值范围内RH主要以内酰胺环形式存在[35]．pH 值在3.0～5.5 范围内，RH-Fe3+的荧光强度较大，当pH 值=5.5 时，I/I0最大．pH 值对RH-Cr3+影响实验也获得相似的结果． 因此，pH 值=5.5 是RH 识别Fe3+和Cr3+的最佳pH 值．

2.3 RH 与Fe3+和Cr3+相互作用研究

利用荧光滴定技术研究探针RH 与Fe3+和Cr3+的相互作用模式，结果如图4 所示．

图4 不同浓度Fe3+下RH 的荧光光谱以及RH 与CFe3+的滴定曲线Fig.4 Fluorescent spectrum of RH upon addition of various amount of Fe3+and titration curves of RH versus CFe3+

由图4（a）可以看出，以内酰胺螺环结构存在的RH 在554 nm 处有很弱的荧光[2，17-19，21，23]． 随着Fe3+浓度的增大，荧光强度比值I/I0大幅上升，表明RH 内酰胺螺环结构发生开 环并与Fe3+配位[29-31，35]． Fe3+的浓度为300.0 μmol/L 时，荧光强度比值I/I0约为50，此后，继续滴加Fe3+，荧光强度比值I/I0变化趋缓，达到平衡．根据Fe3+浓度改变引起的荧光强度比值的变化绘制I/I0-CFe3+关系曲线，结果如图4（b）所示． Fe3+浓度在15.0～100.0 μmol/L 范围内，荧光强度比值I/I0与CFe3+呈现较好的线性关系（R2= 0.988 3）． 根据公式3σ/slop[29-31，35]可得出，RH 对Fe3+的检测限为0.20 μmol/L． 根据非线性最小二乘法方程对I/I0-CFe3+进行拟合[32-33]，结果如图4（c）所示． 可计算出RH-Fe3+的络合常数为7.7 ×103L/mol（R2= 0.972 4）． 较好的相关系数也证实了RH 以1 ∶1 的计量比与Fe3+键合[32-33]．

Cr3+诱导RH 产生了与RH-Fe3+体系类似的光谱变化，但相同条件下荧光强度比值I/I0较小，如图5 所示．

图5 不同浓度Cr3+下RH 的荧光光谱以及RH 与CCr3+的滴定曲线Fig.5 Fluorescent spectrum of RH upon addition of various amount of Cr3+and titration curves of RH versus CCr3+

Cr3+浓度范围为400～900 μmol/L 时，荧光强度比值I/I0值与Cr3+浓度呈现较好的线性关系（R2=0.964 6），可作为Cr3+定量识别的标准曲线，检测限为0.89 μmol/L[29-31，35]． 根据滴定曲线，经非线性最小二乘法方程拟合得到RH 与Cr3+的络合常数[32-33]为1.59×103L/mol，低于RH 与Fe3+的络合常数，证明了前面的假设．此外，较好的相关系数（R2=0.988 6）表明RH 与Cr3+也形成了1 ∶1 络合物[32-33]．

根据上述结果，推断RH 与Fe3+和Cr3+的作用模式如图6 所示.

图6 RH 与Fe3+（或Cr3+）的结合方式Fig.6 Proposed binding mode between RH and Fe3+（or Cr3+）

3 结论

本文利用荧光光谱研究了罗丹明6G 酰肼阳离子的识别与传感性能.实验结果表明：在乙醇/Tris-HCl缓冲溶液（V乙醇∶VTris-HCl=1∶9，pH 值=5.5）中，探针RH 可选择性识别Fe3+和Cr3+，均与Fe3+和Cr3+以1 ∶1 的化学计量比键合；荧光强度比值I/I0增幅与Fe3+和Cr3+分别在15～100 μmol/L 和400～900 μmol/L 的浓度范围内呈线性关系，其检测限分别为0.20 μmol/L 和0.89 μmol/L．