互花米草入侵对天津滨海湿地土壤可培养细菌和真菌群落组成及多样性的影响

霍玉珠，王银华，王春萍，王丽霞，马成仓，郭宏宇

（1.天津师范大学生命科学学院，天津300387；2.天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室，天津300387）

互花米草（Spartina alterniflora）原产于北美大西洋沿岸，1979 年互花米草被引入我国用于沿海地区的海岸线防护[1].引种成功后互花米草在我国沿海地区迅速扩张，目前互花米草入侵面积已达约50 000 hm2[2]，已成为沿海湿地中最主要的入侵植物之一，对我国沿海湿地生态系统产生了多方面的影响[3].研究表明，互花米草入侵可改变湿地土壤理化性质[4]、湿地植物群落组成[5]及湿地生态系统中的物质循环过程[6-7].

湿地土壤微生物是湿地生态系统的重要组成部分，在推动物质循环、能量流动、维持生态系统稳定方面发挥着重要作用[8].研究表明，互花米草入侵会对湿地土壤理化性质和土壤微生物群落产生显著影响.如郑洁等[9]在福建闽江河口湿地的研究发现，互花米草入侵使红树林土壤质量发生明显退化，土壤微生物群落多样性指数明显下降；Cui 等[10]在江苏盐城沿海湿地的研究发现，互花米草入侵使硫酸盐还原菌（SRB）群落的丰富度和多样性显著提高；Liu 等[11]在九江红树林湿地的研究表明，互花米草入侵改变了土壤细菌群落组成和功能；Yang 等[12]在江苏盐城湿地自然保护区的研究显示，互花米草入侵使土壤真菌功能类群发生了改变，其中腐生真菌的相对丰度显著增加，共生真菌和病原性真菌的相对丰度显著降低.

天津滨海湿地位于渤海湾西岸，在维持生物多样性、调蓄洪水、降解污染物、调节气候等方面发挥着重要的生态功能[13].近年来，天津滨海湿地中互花米草入侵日益加剧[14]，而目前关于天津滨海湿地中互花米草入侵对土壤微生物群落组成和多样性影响的研究尚未见报道.本研究通过对比分析不同程度互花米草入侵条件下天津滨海湿地土壤可培养细菌和真菌群落组成及多样性的差异，探究互花米草入侵对天津滨海湿地土壤微生物群落的影响.研究结果将为更好地保护和合理利用天津滨海湿地土壤微生物资源，有效发挥其在天津滨海湿地生态系统中的作用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

2019 年4 月份，在天津滨海湿地有入侵互花米草群落的同一区域内（38°39′N，117°34′E），选择互花米草入侵程度不同的3 个样地：尚未入侵样地（NI），主要植被为芦苇（Phragmites australis）；中等入侵样地（MI），互花米草和芦苇相对盖度均约为50%；完全入侵样地（CI），主要植被为互花米草.在每个样地中随机选定5 个重复样方，在每个样方中用五点采样法采集0～20 cm 土壤样品，充分混匀后放入无菌样品袋密封并标记，带回实验室-20 ℃保存.

1.2 实验方法

1.2.1 土壤理化性质分析

土壤含水量（SWC）采用烘干称重法测定，土壤pH值采用酸度计法测定（土水质量比为1 ∶1）；土壤有机质含量（SOM）采用燃烧法测定；土壤盐度（S）采用重浸法测定，土壤总氮（TN）和硝态氮（NO3--N）含量采用紫外分光光度法测定；土壤亚硝态氮（NO2--N）含量采用盐酸萘乙二胺分光光度法测定；土壤铵态氮含量（NH4+-N）采用靛酚蓝比色法测定；土壤有效磷（AP）含量采用钼酸铵分光光度法测定.

1.2.2 土壤细菌和真菌的分离与鉴定

采用经典稀释涂布平板法对土壤样品中可培养细菌与真菌的群落组成进行分析.先进行预实验确定土壤稀释倍数，使平板上菌落数量约为30～300 个.对稀释后的菌液进行涂布.采用牛肉膏蛋白胨培养基对细菌进行培养，37 ℃条件下培养2～3 d；采用孟加拉红培养基对真菌进行培养，28 ℃条件下培养3～5 d.利用菌落计数器对不同形态的菌落进行计数，用划线法将其纯化为单一形态的菌落. 利用细菌和真菌基因组DNA 提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）分别提取细菌和真菌基因组DNA，并以其为模板对特定片段进行PCR 扩增. 利用引物1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）和27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）扩增细菌16S rRNA 基因片段，利用引物Geo A2（5′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）和Geo11（5′-ACCTTGTTACTTTTACTTCC-3′）扩增真菌18S rRNA 基因片段.扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，应用BLAST 程序（http：//blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对测序结果进行比对分析.

1.3 数据处理

根据各样方中的细菌和真菌群落组成数据，分别计算细菌和真菌群落的Shannon-Wiener 多样性指数（H）和Simpson 多样性指数（D），计算公式如下：

式中：Pi表示群落中第i 个物种的个体数占群落中个体总数的比例.

应用SPSS19.0 软件对数据进行单因素方差分析，并进行Tukey HSD 多重比较分析，应用SigmaPlot13.0软件作图.应用PAST 3 软件对土壤微生物群落组成特征进行非度量多维尺度分析（NMDS）.应用Canoco 5软件对土壤微生物群落组成和土壤理化因子间的相关关系进行冗余分析（RDA）.

2 结果与分析

2.1 互花米草入侵程度对天津滨海湿地土壤理化性质的影响

不同的互花米草入侵程度下，天津滨海湿地土壤理化性质的差异如表1 所示.由表1 可以看出，不同样地间土壤含水量、土壤盐度和土壤有机质含量无显著差异，表明互花米草入侵对天津滨海湿地的这3个土壤因子尚未有显著影响（P ＞0.05）；不同样地间土壤pH 值有显著差异，且呈现出随互花米草入侵程度的增加土壤pH 值逐渐降低的趋势（P ＜0.05）；土壤总氮含量、硝态氮含量、亚硝态氮含量、铵态氮含量和有效磷含量均随互花米草入侵程度的增加呈先升高再降低的变化趋势（P ＜0.01）.

表1 不同互花米草入侵程度条件下天津滨海湿地土壤的主要理化性质Tab.1 Soil properties in Tianjin coastal wetland under different S.alterniflora invasion extents

2.2 互花米草入侵程度对天津滨海湿地土壤中可培养细菌和真菌数量的影响

在不同的互花米草入侵程度下，天津滨海湿地土壤可培养细菌和真菌的数量如图1 所示.由图1 可以看出，互花米草入侵对土壤中可培养细菌和真菌的数量影响显著（P ＜0.05），随着互花米草入侵程度的增加，土壤可培养细菌和真菌的数量均呈先增加后下降的趋势，且在互花米草完全入侵样地（CI）中土壤可培养细菌和真菌的数量均显著低于尚未入侵样地（NI）和中等入侵样地（MI）（P ＜0.05）.

图1 天津滨海湿地不同互花米草入侵程度条件下土壤可培养细菌和真菌数量Fig.1 Quantities of culturable soil bacteria and fungi in Tianjin coastal wetland under different S.alterniflora invasion extents

2.3 互花米草入侵程度对天津滨海湿地土壤中可培养细菌和真菌群落组成的影响

本研究在天津滨海湿地土壤中分离得到可培养细菌和真菌各12 个属.分析结果表明，互花米草入侵对天津滨海湿地土壤中可培养细菌和真菌的群落组成有显著影响.如图2（a）所示，尚未入侵样地中土壤可培养细菌有9 个属，中等入侵样地中土壤可培养细菌有10 个属，完全入侵样地中土壤可培养细菌有6个属.不同样地土壤中均含有芽孢杆菌属（Bacillus）、放线菌属（Actinomyces）、不动杆菌属（Acinetobacter）和考克氏菌属（Kocuria），其中芽孢杆菌属在各个样地中都占有较高的比例.红球菌属（Rhodococcus）、节杆菌属（Arthrobacter）和溶杆菌属（Lysobacter）出现在尚未入侵样地和中等入侵样地土壤中，诺卡氏菌属（Nocardia）和假单胞菌属（Pseudomonas）仅出现在中等入侵样地土壤中，葡萄球菌属（Staphylococcus）仅出现在尚未入侵样地土壤中，类芽孢杆菌属（Paenibacillus）出现在中等入侵样地和完全入侵样地土壤中.

图2 天津滨海湿地不同互花米草入侵程度条件下土壤可培养细菌和真菌群落组成Fig.2 Community composition of soil culturable bacteria and fungi in Tianjin coastal wetland under different S.alterniflora invasion extents

如图2（b）所示，尚未入侵样地土壤可培养真菌有7 个属，中等入侵样地中土壤可培养真菌有9 个属，而完全入侵样地土壤可培养真菌有6 个属.不同样地土壤中均含有曲霉属（Aspergillus）、木霉属（Trichoderma）和青霉属（Penicillium）.镰刀菌属（Fusarium）和链格孢属（Alternaria）出现在尚未入侵样地和中等入侵样地土壤中，根霉属（Rhizopus）和短梗霉属（Aureobasidiu）仅出现在尚未入侵样地土壤中，毛霉属（Mucor）和绿僵菌属（Metarhizium）出现在中等入侵样地和完全入侵样地土壤中，弯孢霉属（Fusarium）仅出现在完全入侵样地土壤中，玛丽亚霉属（Mariannaea）和单格孢属（Monodictys）仅出现在中等入侵样地土壤中.

对不同样地土壤可培养细菌和真菌群落组成进行NMDS 分析，结果如图3 所示.

由图3 可以看出，细菌群落和真菌群落分别按照不同样地有明显的聚集趋势，表明不同互花米草入侵程度对天津滨海湿地土壤可培养细菌和真菌群落组成有显著的影响.

图3 天津滨海湿地不同互花米草入侵程度条件下土壤可培养细菌和真菌群落组成的非度量多维尺度分析（NMDS）（基于Bray-Curtis 相异系数）Fig.3 NMDS analysis of the community composition of culturable soil bacteria and fungi（Based on Bray-Curtis dissimilarity index）in Tianjin coastal wetland under different S.alterniflora invasion extents

2.4 互花米草入侵程度对天津滨海湿地土壤可培养细菌和真菌群落多样性的影响

图4 不同互花米草入侵程度条件下天津滨海湿地土壤可培养细菌和真菌的群落多样性Fig.4 Community diversity indexes of culturable bacteria and fungi in Tianjin coastal wetland soil under different S.alterniflora invasion extents

不同互花米草入侵程度下，天津滨海湿地土壤可培养细菌群落和真菌群落的多样性特征如图4 所示.由图4 可以看出，互花米草入侵对天津滨海湿地土壤可培养细菌群落和真菌群落的Shannon-Wiener 多样性指数和Simpson 多样性指数均有显著影响（P ＜0.05）.随着互花米草入侵程度的增加，细菌群落和真菌群落的Shannon-Wiener 多样性指数和Simpson 多样性指数均呈先升高再降低的趋势，互花米草完全入侵样地的多样性指数显著低于尚未入侵样地和中等入侵样地的数值（P ＜0.05）.

2.5 土壤可培养细菌和真菌群落组成与土壤理化性质间的相关关系

不同互花米草入侵程度条件下，天津滨海湿地土壤可培养细菌和真菌群落组成与土壤理化性质间的冗余分析（RDA）结果如图5 所示，各土壤因子对微生物群落组成变异的解释度如表2 所示.由图5（a）可以看出，前2 个RDA 轴的特征值分别为0.622 8 和0.221 9，对细菌群落组成变异的解释度为84.47%.由表2 可知，对土壤可培养细菌群落组成起主导作用的土壤因子为铵态氮含量（解释度为45.80%，P ＜0.01）和亚硝态氮含量（解释度为27.60%，P ＜0.01）.类芽孢杆菌属与土壤有机质含量和盐度呈正相关关系，与土壤pH 值呈负相关关系；红球菌属、诺卡氏菌属、节杆菌属、溶杆菌属、考克氏菌属和假单胞菌属与土壤亚硝态氮含量、硝态氮含量、总氮含量、铵态氮含量和有效磷含量均呈正相关关系.

由图5（b）可以看出，前2 个RDA 轴的特征值分别为0.551 4 和0.368 6，对真菌群落组成变异的解释度为91.00%.由表2 可知，对土壤可培养真菌群落组成起主导作用的土壤因子为铵态氮含量（解释度为53.30%，P ＜0.01）、亚硝态氮含量（解释度为18.70%，P ＜0.01）、有效磷含量（解释度为10.10%，P ＜0.05）. 曲霉属、单格孢属和玛丽亚霉属与土壤有效磷、铵态氮、硝态氮和总氮含量均呈正相关关系；毛霉属、绿僵菌属和木霉属与土壤亚硝态氮含量呈正相关关系；链格孢属、镰刀菌属、根霉属、青霉属和短梗霉属与土壤pH 值呈正相关关系；弯孢霉属与土壤盐度呈正相关关系.

图5 不同互花米草入侵程度条件下天津滨海湿地土壤可培养细菌和真菌群落组成与土壤理化性质间相关关系的冗余分析Fig.5 RDA between the composition of culturable bacterial and fungal communities and the physical and chemical properties of soil in Tianjin coastal wetland soil under different S.alterniflora invasion extents

表2 冗余分析中各土壤因子对微生物群落组成变异的解释度Tab.2 Explaining percentage of soil factors in RDA

3 讨论

本研究在天津滨海湿地3 个互花米草入侵程度不同的样地中采集土样，分析互花米草入侵对滨海湿地土壤微生物群落的影响.研究发现，一定程度的互花米草入侵使天津滨海湿地土壤pH 值有所降低，这可能与互花米草凋落物和根系分泌物中含有酸性物质有关[15]，其他研究中也发现互花米草入侵能够使湿地的土壤pH 值降低[12，16].中等程度的互花米草入侵能够使湿地土壤的总氮含量、硝态氮含量、亚硝态氮含量、铵态氮含量和有效磷含量显著增加，这可能是由于互花米草入侵在一定程度上改变了湿地土壤中物质循环的模式[17-19]，已有研究表明互花米草根系的共生固氮菌和从枝真菌有较强的固氮作用[14，20]，且互花米草较芦苇有着更高的根系归还量及更高的凋落物分解速率[21]，从而一定程度的互花米草入侵使土壤中有效氮和有效磷含量显著增加.而互花米草完全入侵样地中有效氮和磷的含量出现下降，可能是因为互花米草群落有较高的生长速率[1]，从而吸收利用了土壤中大量的有效氮和磷.此外，有研究表明互花米草的入侵可显著促进土壤的反硝化作用和N2O 的排放，这可能也是互花米草完全入侵样地中土壤氮含量降低的原因[22-23].

中等程度的互花米草入侵使天津滨海湿地土壤可培养细菌和真菌的数量显著增加，这可能是由于一定程度的互花米草入侵显著提高了土壤有效氮和磷的含量，从而可以供给更多数量的微生物生长[24]，有研究指出一定程度的氮输入增加可缓和湿地土壤中氮素含量的限制，从而促进微生物总量的增加[25].在互花米草完全入侵样地中土壤可培养细菌和真菌的数量显著降低，这可能是由于互花米草群落的快速生长吸收利用了土壤中大量的有效氮和磷等营养物质，从而使土壤微生物数量降低[26].这样的现象也出现在其他湿地生态系统中，如Yang 等[27-28]在江苏盐城滨海湿地的研究表明，随着互花米草入侵时间和程度的增加，当地湿地土壤中细菌和真菌的数量均显著降低.

本研究结果表明，互花米草入侵对天津滨海湿地土壤的可培养细菌和真菌群落组成及其多样性有显著影响，总体上多样性指数随互花米草入侵程度的增加呈先升高再降低的趋势.这可能是由于中等程度互花米草入侵条件下，天津滨海湿地土壤有效氮和磷等营养物质含量较高，从而有利于更多种类微生物的生存[29]；而在互花米草完全入侵条件下，土壤中大量有效营养物质被互花米草群落吸收利用，导致土壤微生物种类和多样性降低[30].此外，本研究显示互花米草完全入侵条件下土壤中可分泌抗生素的微生物数量有所增加，如木霉属和青霉属，可能会抑制对抗生素敏感的微生物类群，这也可能是该条件下土壤微生物多样性降低的原因之一.

本研究发现，不同互花米草入侵程度样地中土壤细菌群落构成主要受土壤铵态氮和亚硝态氮含量的影响，而土壤真菌群落组成主要受土壤铵态氮、亚硝态氮和有效磷含量的影响.已有研究表明，铵态氮是细菌和真菌的主要氮源之一，会显著影响土壤细菌和真菌群落组成[31-33]；而磷元素也是土壤养分循环和调控土壤微生物群落构成的重要限制性因子[34-35]，本研究结果与这些研究一致.本研究进一步表明，土壤亚硝态氮含量也是不可忽视的影响湿地土壤微生物群落构成的重要因子之一.

综上所述，互花米草入侵将改变天津滨海湿地土壤的理化性质，进而对湿地土壤微生物群落组成和多样性产生显著影响.一定程度的互花米草入侵可能会在短期内改善湿地土壤营养条件，有利于湿地土壤微生物的生存和生长，提高微生物多样性.然而，随着互花米草入侵程度的进一步增加，土壤营养水平反而会有所降低，这将长期对天津滨海湿地土壤微生物群落组成和多样性产生不利影响.