基于生物信息数据库分析FEN1基因在乳腺癌中的表达及其临床意义

李镠祎 曹奔奔 张婷 王晨 杨红健 戴五敏 蔡昀方

乳腺癌是全球范围内女性最常见的恶性肿瘤，其死亡率居于女性恶性肿瘤的第二位[1]。近年来，随着生活方式、饮食习惯等多因素的改变，全球乳腺癌的发生率和死亡率都呈现上升趋势，在过去的40 年中，东亚女性的发病率更是迅速增加[2-3]。恶性肿瘤的发生、发展常涉及基因突变、基因表达异常、染色体畸变等遗传学改变。瓣状核酸内切酶1（flap endonuclease 1,FEN1）基因是BRCA2 合成致死（BRCA2 synthetic lethality,B2SL）基因的一种，编码一种结构特异性内切酶，参与冈崎片段成熟、DNA 重组、细胞凋亡DNA 片段化和长片段碱基切除修复等过程，在维持基因组稳定性和完整性方面发挥着重要作用[4-5]。FEN1 基因的功能缺陷（以体细胞突变和多态性形式出现）近来已被证明可导致自身免疫疾病、慢性炎症以及促进癌症的发生、发展。研究证明，FEN1 表达水平在前列腺癌、卵巢癌、肺癌等多种恶性肿瘤中增高，其中乳腺癌和子宫癌的表达水平增高更为明显，此外，FEN1 对于癌细胞的快速增殖至关重要，FEN1 基因的变异可降低女性患乳腺癌的风险，将FEN1 基因作为一个靶向治疗的靶点可以阻止乳腺癌进展[6-8]。本研究主要通过检索Oncomine、基因表达谱动态分析（gene expression profiling interactive analysis,GEPIA）、人类蛋白质图谱（human protein atlas,HPA）、肿瘤单细胞（CancerSEA）数据库和Kaplan-Meier Plotter 在线工具分析FEN1 基因在乳腺癌中的表达及其与临床病理分期、细胞功能状态、预后的相关性，为进一步探讨FEN1 基因在乳腺癌的发生、发展过程中的作用机制提供依据。

1 材料和方法

1.1 从Oncomine 数据库提取数据 Oncomine 数据库（https://www.oncomine.org/）是目前世界上最大的肿瘤基因芯片数据库及数据整合提取的平台，其中一项重要功能就是进行肿瘤组织和正常组织的基因差异表达分析[9-10]。研究者可根据自己的需要设定数据挖掘的条件，本研究的检索条件如下：（1）Gene：FEN1；（2）Analysis Type:Cancer vs Normal Analysis；（3）数据集筛选标准P 值＜0.0001，fold change 2，gene rank=Top 10%。

1.2 从GEPIA 数据库提取数据 GEPIA 数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/）是在肿瘤基因图谱（the cancer genome atlas,TCGA）与基因型-组织表达（the genotypetissue expression,GTEx）这两大转录组数据库基础上建立的可视化癌症大数据分析平台[10-11]。检索条件如下：（1）“Expression DIY”框中点击“Boxplot”；（2）Gene：FEN1；（3）Cancer name：BRCA；比较乳腺癌组织和正常乳腺组织的表达量。另一方面：（1）“Expression DIY”框中点击“Stage plot”；（2）Gene：FEN1；（3）Cancer name：BRCA；比较不同分期的乳腺癌FEN1 表达量。P＜0.05 为差异有统计学意义。

1.3 从HPA 数据库提取数据 HPA 数据库（https://www.proteinatlas.org/）是一个基于免疫组化的大型蛋白质表达谱数据库，包含24 000 种蛋白质在肿瘤组织、正常组织和细胞中的分布信息，通过免疫组化技术分析比较正常组织和肿瘤组织中蛋白的表达水平[12]。在HPA 数据库“Tissue Atlas”和“Pathology Atlas”中输入FEN1，分别选择“Breast”和“Breast cancer”，生成免疫组化图，可视化乳腺癌组织和正常乳腺组织中FEN1基因编码蛋白的表达水平。

1.4 Kaplan-Meier Plotter 在线分析 Kaplan-Meier Plotter 在线分析工具（http://www.kmplot.com/）是一种包括基因表达数据和临床数据的在线分析工具[13]。利用Kaplan-Meier Plotter 在线分析工具对乳腺癌患者总生存率（overall survival，OS）进行分析，设置条件：（1）Cancer type：Breast cancer；（2）Gene：FEN1；（3）Survival：OS。log-rank 检验P＜0.05 为差异有统计学意义。

1.5 从CancerSEA 数据库提取数据 CancerSEA 数据库（http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/）是一个单细胞测序数据库，它总共包含来自25 种癌症的41 900个癌细胞，可全面探索癌细胞在单细胞水平上的功能状态[14]。检索条件如下：（1）Gene：FEN1；（2）Cancer Types:Breast cancer。

1.6 统计学处理 乳腺癌组织与正常乳腺组织中FEN1 基因表达比较采用两独立样本t 检验；不同临床病理分期乳腺癌患者FEN1 基因表达水平比较采用单因素方差分析；FEN1 基因表达与患者预后的关系采用Kaplan-Meier 生存曲线，两组生存率比较采用logrank 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FEN1 基因在不同类型肿瘤中的表达 按照预设筛选条件进行检索，Oncomine 数据库中共收集384 项关于FEN1 基因在不同类型肿瘤组织与正常组织中表达的比较研究结果。其中FEN1 基因表达差异有统计学意义的研究结果共61 项，FEN1 基因呈高表达的研究有58 项，呈低表达的研究只有3 项。另外，证明乳腺癌组织中FEN1 基因表达升高的研究有8 项，研究数量仅次于肺癌居第二（图1，见插页）。

图1 瓣状核酸内切酶1（FEN1）基因在Oncomine 数据库中所有肿瘤类型中的表达情况（红色表示上调，蓝色表示下调，颜色越深表示显著性越高）

2.2 FEN1 基因在乳腺癌中的表达情况 经过筛选，GEPIA 数据库中，乳腺癌组织中FEN1 基因的转录水平与正常乳腺组织相比明显增加（P＜0.05），见图2a。此外，通过检索HPA 数据库，获得了乳腺癌组织和正常乳腺组织中FEN1 的免疫组化染色图像（图2b），免疫组化结果显示乳腺癌组织中FEN1 基因的表达水平明显高于正常乳腺组织。

图2 瓣状核酸内切酶1（FEN1）基因在乳腺癌中的表达情况[（a：基因表达谱动态分析（GEPIA）数据库中FEN1 基因在乳腺癌与正常乳腺组织中的表达差异；b：人类蛋白质图谱（HPA）数据库中FEN1 基因在乳腺癌与正常乳腺组织中的免疫组化分析；免疫组化染色，×200]

2.3 FEN1 基因的表达水平与乳腺癌临床病理分期的关系 在GEPIA 数据库中分析FEN1 基因表达水平与乳腺癌临床病理分期的关系，发现不同临床病理分期乳腺癌患者FEN1 基因表达水平比较差异有统计学意义（F=2.68，P＜0.05），见图3。

图3 基因表达谱动态分析（GEPIA）数据库中瓣状核酸内切酶1（FEN1）基因在乳腺癌不同临床病理分期中的表达情况

2.4 FEN1 基因表达水平与乳腺癌患者预后的关系Kaplan-Meier Plotter 在线工具分析显示:乳腺癌患者FEN1 基因不同表达水平与预后具有相关性。从总体来看，FEN1 基因高表达组患者OS 低于低表达组（P＜0.05）（图4a）。亚组分析：（1）淋巴结：淋巴结转移阴性患者FEN1 基因低表达组OS 高于高表达组（P＜0.05），但淋巴结转移阳性患者低表达组和高表达组OS 比较差异无统计学意义（P ＞0.05）（图4b-c）；（2）免疫组化：免疫组化结果分别为雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性、ER 阴性、孕激素受体（progesterone receptor，PR）阳性、PR 阴性、人类表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阳性和Her2阴性的患者，ER 阳性和HER2 阴性患者FEN1 基因低表达组OS 高于高表达组（均P＜0.05）（图4d、4i），而ER 阴性、PR 阳性、PR 阴性、HER2 阳性患者低表达组和高表达组OS 比较差异均无统计学意义（均P ＞0.05）（图4e-h）；（3）分子分型：Luminal A 型、Luminal B 型患者FEN1 基因低表达组OS 高于高表达组（均P＜0.05）（图5a-b），HER2 过表达型和基底细胞（Basal-like）型患者中FEN1 基因低表达组和高表达组间OS 比较差异均无统计学意义（均P ＞0.05）（图5c-d）。

2.5 FEN1 基因在单个细胞里的功能 CancerSEA 数据库的功能相关分析表明，在单个乳腺癌细胞中FEN1基因表达与多种细胞功能状态相关，其中与细胞凋亡、细胞周期、分化、DNA 损伤、DNA 修复、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、转移、细胞增殖和侵袭均呈正相关（均P＜0.05），与血管生成、组织缺氧、炎症、细胞沉默和干细胞性均呈负相关（均P＜0.05）（图6）。进一步对FEN1 基因与乳腺癌细胞功能状态的相关性进行分析，Braune 等[15]和Jordan 等[16]两项研究均显示FEN1 基因的表达与细胞凋亡、细胞周期、DNA 损伤、DNA 修复、EMT、癌细胞侵犯、细胞增殖呈正相关，其中r 值较高的有细胞周期、DNA 损伤、DNA 修复，分别为0.70/0.65、0.51/0.65、0.69/0.69（图7，见插页）。

图4 Kaplan-Meier Plotter 数据库中瓣状核酸内切酶1（FEN1）基因表达水平与不同乳腺癌人群预后的关系[a：淋巴结转移阴性人群；b：淋巴结转移阳性人群；c：雌激素受体（ER）阳性人群；d：ER 阴性人群；e：孕激素受体（PR）阳性人群；f：PR 阴性人群；g：人类表皮生长因子受体-2（HER2）阳性人群；h：HER2 阴性人群]

图5 Kaplan-Meier Plotter 数据库中瓣状核酸内切酶1（FEN1）基因表达水平与不同分型的乳腺癌预后之间的关系[a：Luminal A 型；b：Luminal B 型；c：人类表皮生长因子受体-2（HER2）型；d：基底细胞（Basal-like）型]

图6 肿瘤单细胞（CancerSEA）数据库中瓣状核酸内切酶1（FEN1）基因表达与不同恶性肿瘤细胞功能状态的相关性

图7 肿瘤单细胞（CancerSEA）数据库中乳腺癌细胞瓣状核酸内切酶1（FEN1）基因表达与癌细胞功能状态的相关性

3 讨论

随着治疗方式的不断改进，乳腺癌患者的预后得到了极大的改善，然而由于生活方式、饮食习惯等多方面的改变，乳腺癌的发病率仍呈明显上升趋势，是全球女性最常见的恶性肿瘤，严重威胁女性的身心健康[17]。乳腺癌的发生、发展和转移是一个复杂的过程，基因表达的异常在这一过程中起着重要作用，但是其具体机制目前仍未得到明确阐述。因此进一步探索乳腺癌具体的发生、发展机制，挖掘有效的基因靶点对乳腺癌的诊断治疗及预后评估具有重要的临床意义。

FEN1 基因是重要的的抑癌基因，其编码的FEN1是一种结构特异性核酸酶，参与了长片段碱基切除修复和DNA 复制过程中冈崎片段的成熟，此外FEN1 在DNA 修复、DNA 复制和其他多种DNA 代谢途径中发挥作用，被认为是维持基因稳定和DNA 复制的关键酶[18]。He 等[7]研究证明FEN1 基因不仅在乳腺癌中过表达，并且对于乳腺癌细胞的快速增殖至关重要。当乳腺癌细胞中的FEN1 基因被抑制时，可导致DNA 复制的延迟和未修复的DNA 中间体的积累，从而导致DNA 双链的断裂和细胞凋亡[19]。抑制FEN1 的活性，或许可以抑制癌细胞的生长。临床上使用的大多数化疗药物通过诱导DNA 损伤引起细胞凋亡，然而由于DNA 修复蛋白在癌细胞中的过表达而导致的高效率DNA 修复显著降低了药物功效，癌细胞DNA 修复能力的提高可导致耐药性的产生[20-21]。基于FEN1 具有的DNA 修复功能，抑制FEN1 基因或许可以增加癌细胞对化疗药物的敏感性。鉴于FEN1 的DNA 复制和DNA 修复功能，将FEN1 基因作为治疗靶点或许可以成为乳腺癌治疗的有效策略。

本研究通过检索Oncomine 数据库发现，FEN1 基因在多种肿瘤组织中表达增高，如肺癌、乳腺癌和结直肠癌等。此外，通过检索GEPIA 数据库，验证了乳腺癌组织中FEN1 基因的转录水平明显高于正常乳腺组织。通过检索HPA 数据库，生成FEN1 免疫组化图，可视化了乳腺癌组织和正常乳腺组织中FEN1 基因编码蛋白的表达差异，验证了GEPIA 数据库的结论。通过进一步检索GEPIA 数据库，发现不同临床病理分期乳腺癌患者FEN1 基因表达水平差异有统计学意义，因此，FEN1基因的表达水平，或许会随着疾病的进展发生变化，这有待进一步研究。此外，通过Kaplan-Meier Plotter 在线分析显示FEN1 基因高表达组患者OS 低于低表达组，进一步亚组分析显示：淋巴结转移阴性、ER 阳性、HER2 阴性、Luminal A 型和Luminal B 型FEN1 基因低表达组患者OS 高于高表达组，而淋巴结转移阳性、ER 阴性、PR 阳性、PR 阴性、HER2 阳性、HER2 过表达型和基底细胞型患者FEN1 基因高表达组与低表达组比较差异均无统计学意义，有待进一步扩大样本量进行分析。FEN1 基因在生物细胞的DNA 代谢中扮演重要角色，参与DNA 复制和损伤修复过程，还能通过不同的调控机制促进肿瘤的发展及耐药[22]，因此本研究通过CancerSEA 数据库分析FEN1 基因在单个细胞里的功能。分析表明在单个乳腺癌细胞中FEN1基因表达与多种细胞功能状态相关，其中与细胞凋亡、细胞周期、分化、DNA 损伤、DNA 修复、EMT、转移、细胞增殖和侵袭均呈正相关，此外，CancerSEA 数据库涵盖的两项研究均证明FEN1 基因的表达与细胞周期、DNA 损伤、DNA 修复均呈较高的正相关性。

综上所述，本研究通过生物信息学分析FEN1 基因在乳腺癌中高表达，与患者预后相关，并且与乳腺癌细胞的细胞周期、DNA 损伤和DNA 修复等细胞功能具有较高的相关性，FEN1 基因或许可以作为潜在的评估乳腺癌患者预后的标志物和治疗靶标，为临床乳腺癌的治疗及基因靶向药物的研制提供重要理论依据，对乳腺癌的预后具有重要的临床意义。