CXCL3/CXCR2调节乳腺癌细胞上皮-间质转化的作用机制研究

李文燕 祝迪薇 顾艳玲 周晓红 王瑾

趋化因子3（chemokines 3,CXCL3）是一种单链蛋白质，属于CXC 趋化因子家族。在机体稳态条件下，CXCL3 可以由多种细胞产生[1-2]。趋化因子受体2（chemokine receptor 2,CXCR2）是CXCL3 的一个重要受体，CXCL3/CXCR2 中，CXCL3 可以激活CXCR2，介导下游信号的激活，调控细胞迁移、侵袭等，且CXCL3/CXCR2 与多种疾病相关[3-4]，其在肿瘤的发生、发展中起重要作用。CXCL3 作为肿瘤诱导因子，可促进肿瘤细胞的趋化，激活G 蛋白偶联受体，诱导钙动员和细胞外调节蛋白激酶磷酸化，抑制腺苷酸环化酶激活剂活化，降低环腺苷酸水平，从而参与肿瘤的发生、发展[5-6]，但是目前在乳腺癌的研究中鲜有CXCL3/CXCR2 的报道。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transformation,EMT）是肿瘤重要的特征之一，它在人体发育过程中起着关键的作用，而且还参与组织愈合、器官纤维化和癌症发生等过程[7-8]。在肿瘤的发生、发展中，转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）可以抑制细胞的凋亡，诱导Snail 的表达，Snail 是EMT 的重要调控因子，而EMT 的发生与肿瘤细胞的趋化能力有着重要的关系[9]。因此，本研究探讨CXCL3/CXCR2 调节乳腺癌细胞EMT 的作用机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 人乳腺癌细胞株MCF-7（批号：CL-0149）购自武汉普诺赛生命科技有限公司，重组人CXCL3 蛋白（批号：RPB604Hu01）购自武汉云克隆科技有限公司，CXCR2 抑制剂IN-1（批号：101022）购自上海MCE 公司，CCK-8 检测试剂盒（批号：C0037）购自碧云天生物技术有限公司，N-钙黏蛋白（N-cadherin）、β-连环蛋白（β-catenin）、波形蛋白（vimentin）、CXCR2 及E-钙黏蛋白（E-cadherin）（批号：13116、12475、5741、12671、14472）单克隆抗体购自美国cell signaling technology 公司，PI 染色的细胞周期检测试剂盒（批号：S21522）购自美国BD 公司，Transwell 小室购自康宁公司，酶标仪（型号：Multuskan Go 1510）购自美国Thermo 公司，显微镜（Olympusix71）购自德国徕卡公司，流式细胞仪（FASCC）购自美国BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞实验及分组 在CXCL3 对于乳腺癌细胞作用的实验中，将MCF-7 细胞分为对照组A 和CXCL3组A，对照组A 为常规培养的MCF-7 细胞，而CXCL3组A 为加入10 ng/L CXCL3 干预的MCF-7 细胞。在IN-1 干预的实验中，将MCF-7 细胞分为对照组B、CXCL3 组B 和IN-1 组，对照组B 为常规培养的细胞，CXCL3 组B 为加入10 ng/L CXCL3 干预的MCF-7 细胞，而IN-1 组为同时加入10 μM IN-1 和10 ng/L CXCL3干预的MCF-7 细胞。

1.2.2 细胞周期检测 细胞分组后接种在6 孔板中，分别用CXCL3 和IN-1 进行干预，培养24 h 后用胰蛋白酶消化，PBS 洗2～3 次后，3 000 r/min 离心10 min，取细胞，加入50 μl PI 染液避光染色15 min，将细胞转移到流式管中，上机检测。

1.2.3 细胞增殖能力检测 采用CCK-8 法。细胞接种到96 孔板中，待细胞贴壁后，加入CXCL3 或IN-1 进行干预，于6、12、24、48 h 检测细胞增殖能力。在96 孔板中加入10 μl CCK-8 溶液继续孵育4 h。轻轻摇匀培养板后，在450 nm 处检测吸光度（OD）值，同时设置空白培养基为对照。细胞增殖能力=（OD实验组-OD对照）/（OD初始-OD对照）×100%。

1.2.4 平板克隆形成实验 细胞生长至对数期后，消化细胞，调整细胞浓度为1 000 个/孔，接种到6 孔板中，同时采用含有30%FBS 的DMEM 培养基培养2 周，待细胞形成克隆后，弃去培养基，PBS 清洗2 次后加入多聚甲醛固定，结晶紫染色，PBS 洗2～3 次，拍照后计算克隆形成数。

1.2.5 细胞侵袭能力检测 细胞加入Transwell 上层的小室，待细胞贴壁后，加入无血清的DMEM 培养基进行细胞培养，同时在上层的DMEM 培养基中加入CXCL-3 或IN-1 进行干预，而下层小室中加入含20%FBS 的DMEM 完全培养基。细胞培养24 h 进行侵袭后取出，用甲醇固定、0.1%结晶紫染色，镜下计算侵袭细胞数。

1.2.6 EMT 相关蛋白表达水平检测 采用Western blot。细胞培养48 h 后，收集细胞并用PBS 洗2 次后，RIPA+PMSF 蛋白裂解液冰上裂解细胞30 min，3 000 r/min离心后取上清液，加入等体积的上样缓冲液煮沸后采用SDS-PAGE 凝胶进行电泳分离，PVDF 转膜后用脱脂奶粉进行封闭，之后用稀释的N-cadherin、βcatenin、vimentin、CXCR2、E-cadherin 单克隆抗体4 ℃过夜孵育，孵育后采用TBST 漂洗后加入IgG-HRP二抗孵育，ECL 显色液显色后，成像系统成像，并用凝胶定量分析软件Quantity One 4.4 进行相对表达量的测定。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0 统计软件。计量资料以表示，两组间比较采用两独立样本t 检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CXCL3 对于MCF-7 细胞周期的影响 对照组A细胞中G0/G1 期的比例为（82.44±4.18）%，S/M+G2 期为（17.43±2.87）%；CXCL3 组A 细胞中G0/G1 期的比例为（74.54±4.43）%，S/M+G2 期为（25.87±3.42）%；两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图1a。而IN-1 干预后，IN-1 组细胞中G0/G1 期的比例为（79.44±4.21）%，S/M+G2 期为（22.54±2.32）%；CXCL3 组B 细胞中G0/G1 期的比例为（84.23±3.11）%，S/M+G2 期为（15.43±3.11）%；对照组B 细胞中G0/G1 期的比例为（76.43±2.87）%，S/M+G2 期为（21.11±3.42）%；3 组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；两两比较发现，与CXCL3 组B 比较，IN-1组细胞中G0/G1 期的比例下降（P＜0.05），见图1b。

2.2 CXCL3 对于MCF-7 细胞增殖能力的影响 与对照组A 同一时间点比较，CXCL3 组A 细胞增殖能力明显上升（均P＜0.05），提示CXCL3 干预后可以明显提高MCF-7 细胞增殖能力，见图2a。而IN-1 干预后，与CXCL3 组B 同一时间点比较，IN-1 组细胞增殖能力明显下降（均P＜0.05），见图2b。

2.3 CXCL3 对于MCF-7 细胞平板克隆形成的影响与对照组A 克隆形成数（45.87±8.12）比较，CXCL3 组A细胞平板克隆形成数（78.43±12.12）明显增加（P＜0.05），见图3a。而IN-1 干预后，与CXCL3 组B 平板克隆形成数（88.43±11.54）比较，IN-1 组细胞平板克隆形成数（50.54±11.54）明显减少（P＜0.05），见图3b。

2.4 CXCL3 对于MCF-7 细胞侵袭能力的影响 与对照组A 侵袭细胞数（68.87±18.54）比较，CXCL3 组A 侵袭细胞数（135.65±17.65）明显增加（P＜0.05），见图4a。而IN-1 干预后，与CXCL3 组B 侵袭细胞数（129.65±20.54）比较，IN-1 组侵袭细胞数（69.12±14.54）明显减少（P＜0.05），见图4b。

图1 趋化因子3（CXCL3）对于MCF-7 细胞周期改变的影响[a：CXCL3 对于MCF-7 细胞周期的影响；b：抑制趋化因子受体2（CXCR2）后，CXCL3 对于MCF-7 细胞周期的影响]

图2 趋化因子3（CXCL3）对于MCF-7 细胞增殖能力的影响[a：CXCL3 对于MCF-7 细胞增殖能力的影响，与对照组A 同一时间点比较，*P＜0.05；b：抑制趋化因子受体2（CXCR2）后，CXCL3 对于MCF-7 细胞增殖能力的影响，与对照组B 同一时间点比较，*P＜0.05；与CXCL3 组B 比较，△P＜0.05]

2.5 CXCL-3 对于EMT 相关蛋白表达的影响 与对照组A 比较，CXCL3 组A 细胞N-cadherin、β-catenin、vimentin、CXCR2 表达水平均上调，E-cadherin 表达水平下调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。而IN-1 干预后，与CXCL3 组B 比较，IN-1 组细胞N-cadherin、βcatenin、vimentin、CXCR2 表达水平均下调，E-cadherin表达水平上调，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图5。

3 讨论

图3 趋化因子3（CXCL3）对于MCF-7 细胞克隆形成能力的影响[a：CXCL3 对于MCF-7 细胞克隆形成的影响；b：抑制趋化因子受体2（CXCR2）后，CXCL3 对于MCF-7 细胞克隆形成的影响]

图4 趋化因子3（CXCL3）对于MCF-7 细胞侵袭能力的影响[a：CXCL3 对于MCF-7 细胞侵袭能力的影响；b：抑制趋化因子受体2（CXCR2）后，CXCL3 对于MCF-7 细胞侵袭能力的影响]

图5 CXCL3 对于MCF-7 EMT 相关蛋白的影响[a：EMT 相关蛋白表达的电泳图；b：对照组A 和CXCL3 组A 细胞EMT 相关蛋白表达水平比较，与对照组A 比较，*P＜0.05；c：对照组B、CXCL3 组B 和IN-1 组细胞EMT 相关蛋白表达水平比较，与对照组B 比较，*P＜0.05；与CXCL3 组B 比较，△P＜0.05；CXCL3 为趋化因子3；N-cadherin 为N-钙黏蛋白；β-catenin 为β-连环蛋白；vimentin为波形蛋白；E-cadherin 为E-钙黏蛋白；CXCR2 为趋化因子受体2；EMT 为上皮-间质转化]

趋化因子是一类细胞因子的超家族，具有激活和趋化白细胞的作用，它的不同趋化因子在许多疾病的发生、发展中均有重要的作用[10]。尤其是肿瘤的发生、发展过程中,趋化因子表现出双刃剑的作用：一部分趋化因子可能增强宿主抗肿瘤侵入的固有或特异性免疫反应，另一部分可能通过促进肿瘤细胞的增殖和肿瘤血管的生成,发挥促进肿瘤的生长和转移的作用[11]。趋化因子受体是一类表达于细胞膜上的,与趋化因子结合的,含有7 个跨膜区的G 蛋白耦联受体。根据其所结合的配体可将趋化因子受体分为CXC 受体、CC 受体、XC 受体、CX3C 受体4 个亚家族。趋化因子与趋化因子受体结合后,可以参与多种生理和病理过程,如细胞的生长、发育、分化、凋亡、组织损伤、肿瘤的生长和转移等[12-13]。肿瘤的侵袭和转移又以EMT 为基础。EMT 是指上皮细胞在形态学上向间质细胞转变的过程，同时获得迁移的能力。肿瘤细胞在EMT 的过程中发生了明显变化，主要是肿瘤细胞极性改变，与周围细胞和基质细胞联系接触减少。EMT 在肿瘤的转移、侵袭过程中也起到重要的作用。β-catenin 是经典的调节EMT 的信号通路，其作用和β-catenin 的磷酸化/降解有关[14]，β-catenin 与E-cadherin 和骨架蛋白的稳态有关，E-cadherin 表达水平是EMT 主要的标志物，同时vimentin 蛋白也在大部分肿瘤EMT 过程中高表达[15-16]。CXCL3 是一种趋化因子，其受体主要是CXCR2，在临床研究中已经发现CXCL3 和CXCR2 在多种肿瘤中高表达，但是机制尚未明确。

乳腺癌是一种高转移高致死率的恶性肿瘤，乳腺癌经常发生骨转移和脑转移，转移的机制较为复杂。本实验体外培养了MCF-7 细胞，并用重组人CXCL3 蛋白进行干预，结果发现CXCL3 蛋白干预后明显提高了MCF-7 细胞的增殖能力，同时促进了细胞周期的改变。在EMT 发生的过程中，细胞具有高增殖能力是EMT 发生的先决条件，而CXCL3 可以促进细胞增殖。在转移和侵袭的实验中也发现，CXCL3 可以促进细胞侵袭，同时提高细胞克隆形成能力，这与EMT 的发生相关。在机制的检测中发现，CXCL3 可以上调EMT 标志蛋白N-cadherin、β-catenin、vimentin 的表达，同时下调E-cadherin，这说明，细胞对于基质的黏附能力下降，具备了转移和侵袭的能力。CXCR2 作为CXCL3 的受体，在CXCL3 的作用中也扮演着重要的角色，本实验用IN-1 干预后，发现CXCR2 抑制后可以明显抑制CXCL3 的作用，细胞增殖能力下调，同时侵袭能力也下调，最关键的是可以抑制EMT 相关蛋白的表达。这说明CXCL3 是通过CXCR2 发挥作用的。

综上所述，本实验发现CXCL3/CXCR2 的激活可以促进乳腺癌EMT，这有望成为乳腺癌治疗的新靶点。