艾粉及常见混伪品的紫外-可见-近红外指纹图谱鉴别研究

李 超， 李孟芝， 崔占虎， 王 旭， 黄显章

(1.南阳理工学院河南省张仲景方药与免疫调节重点实验室 河南 南阳 473000；2.福建农林大学 福建 福州 350002)

0 引言

艾叶为菊科植物艾ArtemisaargyiLevl et Vant的干燥叶[1]，其性温，味苦、辛，归肝、脾、肾经，具有散寒止痛、温经止血等功效[2,3]。艾叶即可内服又可外用，以其为原料制成的艾绒是中医临床施灸的主要材料，效果较为显著[4,5]。随着对艾叶研究的深入以及禽畜饲料添加剂“禁抗”的需要，艾粉已然成为替代抗生素的理想原料中药材。艾粉作为饲料添加剂有利于禽畜的生长发育和提高机体抗病能力，并显著提高动物的生产性能[6-9]，其开发和使用前景广阔。

近年来，艾产业的快速发展带来了艾叶资源需求量的激增，其价格不断攀升，以致艾粉掺假现象凸显，严重影响了艾粉作为饲料添加剂的安全性和有效性。因此，简单快捷的艾粉及其常见混伪品的鉴别方法亟待探索和建立。

到目前为止，国内外学者对艾叶的研究主要集中在化学成分、药理作用等方面[10-14]，但对艾粉及常见混伪品的鉴别方法尚未研究，本研究结果将为艾粉的质量控制提供一种新的思路和方法，具有重要的现实意义。

1 材料

1.1 仪器与试剂

紫外-可见-近红外分光光度计(3600 Plus，日本岛津)；万分之一分析天平(MS-TS，德国梅特勒)；超声波清洗仪(SY- 3200 T，上海声源)；甲醇、乙酸乙酯及石油醚(分析纯，天津科密欧)；超纯水(ULUP自制)。

1.2 样品采集

艾叶样品按照“Z”字采样法于2018年端午前后在河南省汤阴县伏道镇周边采集；混伪品样品采自伏牛山桦树盘林场，采样方法为随机采样法；提取挥发油后的艾叶样品参照水蒸气蒸馏法完成。以上材料经南阳理工学院黄显章副教授鉴定为菊科蒿属植物艾(Artemisiaargyilevl et Vant)、菊科火绒草属植物薄雪火绒草(LeontopodiumjaponicumMiq)、菊科蒿属植物水蒿(ArtemisiaselengensisTurcz)、菊科蒿属植物野艾蒿(ArtemisialavandulaefoliaDC)、豆科落花生属植物落花生(ArachishypogaeaLinn) 及菊科豚草属豚草(AmbrosiaartemisiifoliaL)。

2 方法

2.1 供试样品的制备

将艾叶、艾杆、提油后的艾叶、薄雪火绒草、水蒿、野艾蒿、豚草、花生壳等样品分别去杂、挑选、粉碎、混匀。制成供试样品8类，分别为：纯艾粉、艾粉+水蒿粉(1∶1)、艾粉+薄雪火绒草粉(1∶1)、艾粉+野艾蒿粉(1∶1)、艾粉+花生壳粉(1∶1)、艾粉+豚草粉(1∶1)、艾粉+提油后的艾叶粉(1∶1)、艾粉+艾杆粉(1∶1)。将上述8种供试品各称取0.2 g(每种供试品称取4份)，分别精密加入纯水、甲醇、石油醚及乙酸乙酯各20 mL，即得32份供试品溶液，超声90 min，稳定后过滤，滤液备用。

2.2 测试条件

紫外-可见-近红外指纹图谱的测定于南阳理工学院河南省方药与免疫调节重点实验室完成。实验环境保持温度在20～25 ℃，湿度在30%～40%。以纯艾叶样品为基准，以纯水、甲醇、石油醚及乙酸乙酯为背景进行参比，并调整基线，稳定后进行测定，设定扫描波长为：190～1500 nm，狭缝为1.0 nm，采样间隔为0.2 nm，测定重复试验3次，以其均值作为检测结果，并以其吸收峰数考察4种溶剂对艾粉及其混伪品化学成分的提取效果并进行记录(已去除噪音背景和阈值异常的干扰波段)。预实验结果表明，艾叶纯水提取液(A)在200～1400 nm之间噪音和干扰较少，但此区域的图谱几乎没有吸收峰的存在，在进一步分析其数据后，未能发掘有效信息，故后续试验予以舍去。甲醇提取液(B)、石油醚提取液(C)、乙酸乙酯提取液(D)分别在200～1200 nm、200～800 nm及200～1400 nm的紫外-可见-近红外图谱中吸收峰较多，且受到干扰较小，故选用甲醇、石油醚和乙酸乙酯为提取溶剂进行下一步分析。

2.3 最佳称样量的确定

准确称取纯艾叶样品0.1 g、0.2 g、0.25 g、0.5 g、1.0 g各3份，分别加入甲醇、石油醚及乙酸乙酯各20 mL，即得15份艾叶样品试液，超声提取时间为90 min，过滤。结果显示，称样量为0.1 g透光率过大，吸收峰也不稳定；而称样量为0.2 g、0.25 g、0.5 g和1.0 g时吸收峰数和吸收强度较为理想，且差异不明显，故将最佳称样量设定为0.2 g。

2.4 最佳提取时间的确定

准确称取多份0.2 g纯艾叶样品，分别加入20 mL甲醇、石油醚及乙酸乙酯，超声提取，时间分别设为30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，提取后过滤。结果显示，提取时间为30 min和60 min时出峰产生漂移，90 min、120 min、150 min较为稳定且吸收峰数和吸收强度差异不明显，故将最佳提取时间确定为90 min。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度的考察

以纯艾叶样品为研究对象，准确称取0.2 g样品多份，分别加入20 mL甲醇、石油醚及乙酸乙酯后，超声提取90 min，分别制备甲醇、石油醚及乙酸乙酯的艾叶提取液，平行测定5次，计算相对标准偏差，其RSD均小于0.52%，即精密度良好。

2.5.2 稳定性的考察

以纯艾叶样品为研究对象，按照2.5.1节中方法制备甲醇、石油醚及乙酸乙酯的艾叶提取液，分别放置0 h、1.0 h、2.0 h、4.0 h、8.0 h、24.0 h后进行测定，计算相对标准偏差，其RSD均小于1.08%，即样品的稳定性良好。

2.5.3 重复性的考察

以纯艾叶样品为研究对象，准确称量艾叶样品5份，按照2.5.1节中方法制备甲醇、石油醚及乙酸乙酯的艾叶提取液并进行测定，计算相对标准偏差，其RSD均小于0.83%，即重复性良好。

3 结果与分析

艾粉与7种常见混伪品(艾叶+水蒿打粉、艾叶+薄血火绒草打粉、艾叶+花生壳打粉、艾叶+野艾蒿打粉、艾叶+豚草打粉、艾叶+提油后艾叶打粉、艾叶+艾杆打粉)的甲醇、石油醚及乙酸乙酯提取液的紫外-可见-近红外指纹图谱见图1。由图1可知，同一溶剂提取的艾粉及混伪品的紫外-可见-近红外指纹图谱相似度较高，不能直观地通过图谱中的峰位、峰强及峰数等参数对其进行区分和鉴别。

3.1 紫外-可见-近红外指纹图谱相似度评价

相似度评价体系是指将所提取到的相似度较高的吸收峰采用正态检验法进行识别，并对组内吸收峰波长极差值与该组和相邻组的平均波长差值大小进行比较。本研究首先借助origin分析软件(9.0，OriginLab公司)拾取特征峰值，结果显示，甲醇提取液的特征峰有12组(524 nm、553 nm、625 nm、756 nm、760 nm、763 nm、774 nm、777 nm、782 nm、787 nm、792 nm、795 nm)，石油醚提取液的特征峰有23组(252 nm、258 nm、265 nm、300 nm、320 nm、341 nm、360 nm、363 nm、462 nm、522 nm、549 nm、556 nm、565 nm、578 nm、584 nm、587 nm、591 nm、631 nm、635 nm、639 nm、642 nm、692 nm、697 nm)，乙酸乙酯提取液的特征峰有18组(381 nm、 447 nm、521 nm、549 nm、624 nm、718 nm、725 nm、732 nm、738 nm、755 nm、763 nm、766 nm、772 nm、778 nm、781 nm、787 nm、791 nm、796 nm)。以纯艾粉的均值特征峰值作为对照，将7种混伪品进行相似度对比，分析结果见表1。

表1 艾粉及混伪品的特征峰和全谱相似度评价

从表1可以看出，纯艾粉与其混伪品的特征峰在3种提取液中的相似度普遍较高，甲醇提取液中的相似度均高于98.9%，石油醚提取液中的相似度均高于97.2%，乙酸乙酯提取液中的相似度均高于99.1%，即借助光谱特征峰的相似度评价不能有效地对纯艾粉及其混伪品进行区分。鉴于上述结果，本研究尝试采用全谱相似度评价代替共有特征峰相似度评价以探索艾粉与混伪品之间的差异，即以共有模式建立纯艾粉的对照图谱，以均值作为对照图谱的吸收强度，分析结果亦见表1。从表1可以看出，纯艾粉与其混伪品的图谱在3种提取液中的相似度较高，甲醇提取液中的相似度均高于94.2%，石油醚提取液中的相似度均高于92.6%，乙酸乙酯提取液中的相似度均高于95.2%，即借助全光谱的相似度评价也不能对纯艾粉及其混伪品进行区分。以上结果表明，特征峰及全光谱相似度评价体系均不能对艾粉及其混伪品进行区分和鉴别，应进一步考虑其他计量学方法挖掘潜在和有效的差异。

3.2 纯艾粉及其混伪品的主成分分析

主成分分析是利用降维的方式将原始的多个变量通过线性变换转化为新的少数综合指标的分析方法，即从原始变量中导出少数的几个主成分，使它们尽可能多地保留原始变量的信息，该方法具有信息损失少、相关最优和回归最优等特点。

在艾粉与混伪品的光谱波段中，选取干扰小、指纹差异大的波段作为分析对象，即甲醇提取液波段350～800 nm、石油醚提取液200～700 nm及乙酸乙酯提取液波段250～800 nm，并组成相关数据矩阵，借助SPSS软件(SPSS 19.0，USA)和SIMCA-P软件(Simca-p 12，Sweden)进行分析，分析结果见表2。从表2中可以看出，甲醇提取液中共提取5个主成分(特征值大于1)，累计可信度为99.56%；石油醚提取液中共提取5个主成分，累计可信度为99.65%；乙酸乙酯提取液中共提取5个主成分，累计可信度为99.75%。以上较高的累计可信度，说明所提取的主成分可替代原始光谱信息进行进一步的分析和挖掘。

表2 主成分的特征值及累计可信度

图2 艾粉及混伪品的不同溶剂提取液PCA得分图

图2为艾粉及其混伪品在甲醇、石油醚及乙酸乙酯提取液的PC1/PC2散点图，从该散点图中可以看出，甲醇提取液的主成分分类效果欠佳，艾粉及混伪品的分布无序且分散，存在多处交叉和超越置信阈值，无法达到理想的分类效果；石油醚提取液的主成分分类效果较为理想，除艾叶+艾杆与艾叶+薄雪火绒草出现部分交叉外，艾粉及混伪品的分布相对独立且集中；乙酸乙酯提取液的主成分分类效果相对最为理想，艾粉及混伪品的分布相对独立且集中，没有出现交叉混乱，象限内分布也比较均匀。因此，基于主成分分析的乙酸乙酯提取液光谱技术适用于艾粉及其混伪品的鉴别与分类，下一步将以乙酸乙酯提取液的光谱数据进行挖掘和分析。

3.3 偏最小二乘判别分析

在3.2节基础上，将艾粉及其混伪品的乙酸乙酯提取液光谱数据代入SIMCA软件进行PLS-DA分析。在PLS模型构建中，将艾粉及混伪品样品数据设置为“class 1～class 8”，自动拟合后进行交叉验证及预测因变量的变化。结果显示，PLS模型共提取到9个主成分，其变量的累积R2Y值和Q2值分别达到98.80%和95.56%，说明该模型的拟合效果较好(见表3)。随机选取艾粉及其混伪品样品借助PLS模型进行预测(已移除观测值)，结果显示艾粉及其混伪均被正确分类。以上结果表明，乙酸乙酯提取液光谱数据结合PLS模型可以有效地对艾粉及其混伪品进行分类。

表3 基于PLS的解释变量和预测变量

4 讨论和结论

近年来，中药指纹图谱技术被广泛地应用于中药材质量评价体系，符合中药整体观念和模糊性特点，并能系统地探寻中药成分的种类和含量分布规律，可用于中药材的产地、部位及真伪鉴别。本研究通过紫外-可见-近红外指纹图谱技术依次考察了纯水、甲醇、石油醚及乙酸乙酯等提取液对艾粉及其常见混伪品的提取效果，发现以甲醇、石油醚及乙酸乙酯为提取溶剂的光谱数据较为丰富，图谱吸收峰多，且受到干扰小。在初步的相似度分析中，借助origin拾取特征峰值，甲醇提取液的特征峰有12组，石油醚提取液的特征峰有23组，乙酸乙酯提取液的特征峰有18组，以纯艾粉的均值特征峰值作为对照，结果显示纯艾粉与其混伪品的特征峰在3种提取液中的相似度普遍较高，甲醇提取液中的相似度均高于98.9%，石油醚提取液中的相似度均高于97.2%，乙酸乙酯提取液中的相似度均高于99.1%，即借助光谱特征峰的相似度评价不能有效的对纯艾粉及其混伪品进行分类。鉴于特征峰分析的失败，又尝试采用全谱相似度评价代替共有特征峰相似度评价以探索艾粉与混伪品之间的差异，分析结果表明，纯艾粉与其混伪品的图谱在3种提取液中的相似度较高，甲醇提取液中的相似度均高于94.2%，石油醚提取液中的相似度均高于92.6%，乙酸乙酯提取液中的相似度均高于95.2%，以上结果表明，特征峰及全光谱相似度评价体系均不能对艾叶及其混伪品进行区分和鉴别。在主成分分析中，通过构建艾粉及其混伪品在甲醇、石油醚及乙酸乙酯提取液的PC1/PC2散点图，发现甲醇提取液的主成分分类效果欠佳，艾粉及混伪品的分布无序且分散，无法达到理想的分类效果；石油醚提取液的主成分分类效果较为理想，但是艾叶+艾杆与艾叶+薄雪火绒草出现部分交叉；而乙酸乙酯提取液的主成分分类效果较为理想，艾粉及混伪品的分布相对独立且集中，说明基于主成分分析的乙酸乙酯提取液光谱数据适用于艾粉及其混伪品的鉴别与分类。在主成分分析的基础上，构建PLS模型，自动拟合后进行交叉验证及预测因变量的变化，结果显示PLS模型变量的累积R2Y值和Q2值分别达到98.80%和95.56%，说明该模型的拟合效果较好，预测结果显示艾粉及其混伪均被正确分类。以上结果表明，乙酸乙酯提取液光谱数据结合PLS模型可以有效地对艾粉及其混伪品进行分类。

综上所述，紫外-可见-近红外指纹图谱技术与化学计量学方法相结合可用于艾粉及其混伪品的分类与鉴别，且此方法操作简便，可为艾粉及其他添加剂的等同性研究提供数据基础和有益参考。