辛伐他汀联合雷奈酸锶对成骨细胞及破骨细胞生物学特性的影响

胡文雄 蒋家正 李华

海南西部中心医院，海南 儋州 571799

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是一种进行性全身性骨骼疾病，其特征是骨量降低和骨微结构发生改变，在绝经后妇女中非常常见[1]。由于雌激素水平和卵巢功能降低，导致成骨细胞形成和破骨细胞吸收之间失衡，引发骨脆性增加和易于骨折[2]。因此，开发有效和安全的PMOP治疗药物已成为当务之急。雷奈酸锶(strontium ranelate，SR)在欧洲国家被广泛用于治疗绝经后妇女的骨质疏松症。众所周知，SR通过增加骨形成和减少骨吸收[3-4]，可以降低椎体和髋部骨折的风险，从而对骨产生合成代谢作用[5-6]。辛伐他汀(simvastatin，SIM)具有降血脂作用，用于治疗心血管疾病。近年来，药学领域一直致力于研究和发现SIM的新作用。已经发现SIM具有促进成骨和抑制破骨作用，且可以显著提高骨组织中BMP-2的表达，这些结果提示SIM可能用于治疗骨质疏松症[7-8]。鉴于SIM以及SR促进成骨和抑制破骨的效果，本研究通过使用SIM以及SR干预成骨细胞和破骨细胞活性的影响，以探索两者联合使用治疗骨质疏松症的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

30只12周龄雌性SD大鼠由上海实验中心提供；辛伐他汀、雷奈酸锶和α-MEM培养基购自GIBCO BRL(Grand Island，NY，USA)；用于基础培养的α-MEM购自HyClone；胎牛血清(FBS)购自GIBCO(目录号：16400-044)；核因子-B配体的人重组受体活化剂(RANKL，cat：400-30，批号：0209437)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF，cat：400-28，批号0310418)购自PeproTech；二抗购自中国北京夏思生物技术有限公司(Pro-spec，cat：SV30010)；针对GSK3β(Ab-9;cat：A7098)、GSK3(cat：B7098)、AKT(Ab-124;cat：B0407)、AKT(磷酸化Ser473;cat：A7005)、基质金属蛋白酶14(cat：CO266)的抗体β-catenin(Ab-33/37;cat：B7022-1)和β-连环蛋白(phospho-Ser33 cat：A7022)购自Assay Biotech；二抗(目录号：Abmart M21001 L，目录号：HA1001)购自Assay Biotech；碱性磷酸酶(ALP)试剂盒购自中国南京建成生物工程研究所(A059-2)。

1.2 方法

1.2.1成骨细胞和破骨细胞的培养:原代成骨细胞来源于出生24 h的乳鼠颅骨，用PBS洗涤。解剖出颅骨后，用含有青霉素/链霉素(PS)的冷PBS溶液洗骨骼2～3次。使用牙钻取出长度、宽度和厚度均为1 mm的骨碎片；将骨样品放置在充满0.1 %胰蛋白酶的离心管中，放置在摇水浴(120 次/min)中20 min。然后，将颅骨放入50 mL离心管中，用0.2 %的胶原酶在37 ℃摇动水浴(120圈/min)中孵育两次共60 min。通过添加生长介质和反复移液终止反应，并使用滤网去除骨碎片。收集滤液，在1 200g离心，4 ℃下离心8 min，然后丢弃上清液。细胞在含10 %胎牛血清和1 % PS(2 mL/孔)的α-MEM中复苏，在37 ℃下用5 % CO2孵育2 d，每3天更换一次培养基[9]。获取5周龄雄性SD大鼠的股骨和胫骨，中间截断股骨和胫骨髓腔使用培养液洗涤。使用大鼠骨髓来源的巨噬细胞的原代培养物诱导形成破骨细胞。将细胞放置于含10 %FBS和1 %PS的α-MEM中培养24 h，培养环境为5 %CO2和37 ℃。然后将非粘附细胞转移到含有M-CSF(25 ng/mL)+ RANKL(50 ng/mL)的α-MEM中培养以观察破骨细胞的形成[10]。

1.2.2茜素红染色:为了检查成骨细胞的基质矿化，将细胞放置于含有50 μg/ mL维生素C和10 mmol/L β-甘油磷酸盐的成骨细胞诱导培养基中。随后一列孔加入 5 mmol /L的 SR (SR组)，一列 孔 加 入5 mmol /L的 SIM(SIM组)，一列孔同时加入2.5 mmol /L的SIM和SR(SIM +SR组)，一列孔不加入任何药物为对照组。将成骨细胞培养21 d后，除去上清液，用PBS冲洗细胞3次；其中使用的SIM和SR剂量对成骨细胞及破骨细胞均未发现毒副作用。然后将细胞用95 %乙醇原位固定10 min，用蒸馏水冲洗两次，用茜素红染色30 min，用蒸馏水冲洗两次，以观察红色矿化结节。使用分光光度计在562 nm的波长下测量所得上清液的光密度。收集对数期大鼠成骨细胞，培养72 h，然后用PBS洗涤3次。在液氮中反复冷冻并解冻后重新收集细胞。使用ALP测试试剂盒(A059-2)测量ALP活性。使用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。使用分光光度计测定各组管的吸光度。

1.2.3ALP活性和骨坑实验:在96孔羟基磷灰石(HA)涂层板(康宁，纽约州，美国)的每孔中加入250 μL等位基因α-MEM，并在37 ℃、5 % CO2中孵育2 d；随后，将非诱导破骨细胞前体添加到固定细胞中，并在37 ℃、5 % CO2中孵育2 d (以下在添加10 %FBS、1 % 25 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL mycillin的诱导培养基中)，随后一列孔加入 5 mmol /L的 SR (SR组)，一列 孔 加 入5 mmol /L的 SIM(SIM 组)，一列孔同时加入2.5 mmol /L的SIM和SR(SIM +SR组)，一列孔不加入任何药物为对照组，培养14 d。使用Media Cybernetics软件分析图像(Silver Spring，MD，USA)[11]。

1.2.4蛋白质印迹分析:根据Bicinchoninic Acid(BCA)试剂盒(Boster，中国武汉)提供的说明书，将细胞样品离心后提取的上层蛋白在装载缓冲液(30 μg/孔)中于95 ℃煮沸，持续10 min。使用12 %凝胶通过电泳分离蛋白质样品，然后使用半干转移系统(Millipore，Bedford，MA，USA)转移至聚偏二氟乙烯膜。在室温下用5 %脱脂奶粉孵育2 h后，将一抗溶液加入膜中并在4 ℃保持过夜;然后将膜用TBS-T缓冲液洗涤5次，每次10 min，并在室温下与对应二抗温育1 h。使用增强的化学发光凝胶成像系统来捕获图像用于分析。

1.3 统计学分析

所有数据均以均数±标准差表示，并使用SPSS19.0(SPSS Inc.，Chicago，IL)通过单因素方差ANOVA分析。P<0.05、P<0.01或P<0.001表示比较差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成骨细胞和破骨细胞AKT/GSK3β/β-catenin/NFATC1信号通路改变

图1显示了单独使用SIM或SR或用SIM联合SR处理后成骨细胞中AKT/GSK3β/β-catenin/NFATC1信号通路的变化。单独给予SIM或SR后，成骨细胞中p-Akt/Akt和β-Gsk3β/Gsk3升高，p-β-catenin/β-catenin和NFATC1/β-catenin降低，在使用SIM联合SR处理后，相同的比率趋势变得更加明显。相比之下，SIM或SR或SIM联合SR处理对破骨细胞中蛋白质含量的比率有相反的影响(图2)。这些结果表明，SIM联合SR对成骨细胞和破骨细胞中AKT/GSK3NFATC1/β/β-catenin/NFATC1信号传导的作用，比单独使用两种药物中的任何一种都要强。

图1 成骨细胞中AKT/GSK3β/β-catenin/NFATC1信号传导的Western blot结果注：a：WB检测结果；b～e：蛋白表达定量结果。Fig.1 Western blot results of AKT/GSK3β/β-catenin/NFATC1 signaling in osteoblasts

图2 破骨细胞中AKT/GSK3β/β-catenin/NFATC1信号传导的Western blot结果注：a：WB检测结果；b～e：蛋白表达定量结果。Fig.2 Western blot results of AKT/GSK3β/β-catenin/NFATC1 signaling in osteoclasts

2.2 成骨细胞和破骨细胞功能的改变

进一步探索了在体外研究SIM联合SR是否会影响破骨细胞的骨形成和吸收能力。此外，评估SIM、SR或SIM联合SR对两种细胞类型的成骨细胞矿化结节形成、破骨细胞骨吸收和功能标志物水平的影响。使用SIM、SR或SIM联合SR处理的成骨细胞的矿化结节形成和ALP活性如图3所示。SIM或SR均能促进成骨细胞矿化结节的形成和ALP活性。然而，SIM联合SR显著增加了形成的矿化结节的数量和成骨细胞的ALP活性。

图3 茜素红染色的矿化结节和成骨细胞ALP活性注：a：茜素红染色的矿化结节；b:矿化相对活性；c：细胞ALP活性。Fig.3 Mineralized nodules as visualized by Alizarin red staining and ALP activity in osteoblasts

图4显示SIM、SR或SIM联合SR处理对破骨细胞骨吸收能力和TRACP活性。单独使用SIM和SR均可降低破骨细胞的骨吸收面积并抑制TRACP的活性；然而，在SIM联合SR联合应用后，骨吸收面积显著降低，并且破骨细胞的TRACP活性明显低于单独使用SIM和SR的结果。这些体外实验结果表明，与单独使用SIM或SR相比，SIM和SR联合应用能更好地促进骨形成，抑制骨吸收。

图4 破骨细胞介导的骨吸收和TRACP活性的改变注：a：骨坑实验结果；b:骨坑定量结果；c：细胞TRACP活性。Fig.4 Osteoclast-mediated changes in bone resorption and TRACP activity

3 讨论

本研究表明SIM和SR均能抑制AKT-GSK3-β-β-catenin-NFATC1信号通路激活，SIM联合SR效果更加。虽然SIM在常规剂量下副作用较小，但是药物疗效有剂量依耐性，特别是在长期应用中，这严重限制了它的临床价值[12]，本研究中选取较低剂量的SIM，通常情况下对细胞无毒副作用[12]。SR治疗骨质疏松症虽然治疗有剂量依耐性，但是较低剂量的副作用发生率更低[5-6]。目前普遍认为联合治疗策略既有效又安全。因此，本研究探讨较低剂量SIM和SR联合治疗骨质疏松症可行性，并测试该方法是否可以通过抑制akt/gsk3β/β-catenin/NFATC1途径抑制破骨细胞活性和促进成骨细胞活性。这种方法可以与细胞水平的主动筛选概念进行比较，以确定有效的药物组合。旨在更清楚地阐明联合药物治疗的机制，为联合疗法治疗骨质疏松症提供理论依据，也为动态骨失衡引起的骨代谢疾病的治疗奠定基础。

研究[13]表明，Wnt信号通路在骨健康和疾病发展中起着至关重要的调节作用，它们可以为骨质疏松症的研究和治疗提供新的靶点。Wnt/β-catenin信号刺激成骨细胞增殖，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，促进成骨细胞表达Osx1，同时抑制脂肪和软骨形成[14]。此外，Wnt通过β-catenin依赖性和β-catenin非依赖性途径阻止成熟成骨细胞的凋亡并延长其生命周期[14]。除了对成骨细胞的影响外，Wnt/β-catenin信号还刺激护骨素的产生和分泌，以减少破骨细胞的分化[15]。最近的研究[15]还表明，破骨细胞中β-catenin的失活可以增加破骨细胞数量和骨吸收，从而减少骨量。在调节GSK3β/NFATC1的AKT信号通路中，发现抑制PI3K可以下调NFATC1的表达，影响小鼠的破骨细胞分化，从而影响骨量和骨强度[16]。这些研究表明AKT-GSK3-β-β-catenin-NFATC1信号通路在骨质疏松的治疗中起着关键作用。

本实验结果表明，SIM和SR单独使用以及SIM和SR联合使用对成骨细胞和破骨细胞中AKT/GSK3β/β-catenin/NFATC1信号通路的影响是一致的。此外，SIM和SR联合的作用明显大于单独使用任何一种药物。最近的研究[17]表明，成骨细胞中NFATC1表达的降低增加了成骨细胞的成骨活性，而破骨细胞中NFATC1表达的降低了这些细胞的骨吸收能力。这些观察表明，SIM和SR联合使用不仅促进骨形成，抑制骨吸收，而且在治疗骨质疏松方面也比单独使用这两种化合物更有效。

本研究试图确定SIM和SR联合使用是否可以促进成骨细胞活性和抑制破骨细胞活性，以及其效果是否优于单独使用这两种药物中的任何一种。因此，观察了矿化结节的形成和成骨细胞的ALP活性以及破骨细胞的吸收能力和TRACP活性。SR在一定程度上增加成骨细胞的活性，但SIM与SR联合使用时，成骨细胞的ALP活性增加更为显著。此外，与单独使用SIM或SR相比，矿化结晶的形成明显增强。与单独SIM或SR使用相比，SIM联合SR干预更显著降低TRACP活性，显著减少破骨细胞介导的骨吸收。虽然SIM联合SR的剂量是单独使用药物剂量的一半，但联合使用的细胞实验效果明显大于单独使用任何一种化合物的效果。

总的来说，SIM联合SR治疗是一种潜在的治疗骨质疏松症的方案，但还需要进一步行体内研究确定。