杜仲腰痛丸调控p53对老年骨质疏松症患者骨密度、骨代谢及骨形成影响的作用机制

朱换平 石敏 张维平 马同 赵继荣*

1.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050 2.兰州市城关区妇幼保健院，甘肃 兰州 730030

人类骨代谢平衡通过骨吸收和新骨形成的耦合来维持[1]。当破坏骨形成和骨吸收之间的平衡时，骨质疏松症就会发生[2]。骨质疏松症是最常见的与年龄相关的慢性疾病之一，随着年龄的增长，骨转换率逐渐下降，导致骨密度(bone mineral density,BMD)和骨矿物质含量(bone mineral content,BMC)逐渐下降[3]。骨质疏松症的发病机理尚未完全阐明。有研究[4]表明，骨质疏松症是一种多因素疾病，多种基因和信号通路参与其发病机理[5]。p53蛋白由TP53基因编码，Jia等[6]证明TP53多态性可能导致骨质疏松症的风险。Tao Yu等[7]同样研究发现，p53在骨质疏松症的发生中发挥关键作用，抑制p53的某些活性可能抑制骨质疏松症的发生和(或)进展。另外，Xie等[8]也发现TP53在原发性骨质疏松症中起关键作用。杜仲腰痛丸(eucommia lumbago pill，ELP)被证明对骨质疏松症具有治疗作用[9]。但ELP是否通过调控p53影响老年骨质疏松症患者的骨密度、骨代谢，尚无相关报道。本研究将通过ELP对临床患者p53的表达水平的影响及其与骨密度、骨代谢指标的相关性进行分析，同时通过体外细胞实验验证ELP是否通过抑制p53的表达，促进骨形成。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1一般资料：选取自2018年3月至2019年8月期间，在甘肃省中医院门诊就诊的老年骨质疏松症患者30例。所有患者均符合WHO对老年骨质疏松症的诊断标准。其中男性12例、女性18例，年龄65～70岁，平均(70.15±2.73)岁。选取同期于本院体检健康的老年男性10名、女性20名为对照组，年龄65～70岁，平均(70.85±3.26)岁。以上两组均自愿加入该临床实验，且均签订知情同意书。排除患有其他骨科疾病、精神疾病及血液病患者，患有严重心肝肾功能损伤患者，对本研究使用药物过敏的患者。将受试者分为对照组(未患骨质疏松症者30例)、OP组(患骨质疏松症者30例)、ELP组(接受杜仲腰痛丸治疗患者30例)。

1.1.2细胞株：小鼠成骨细胞MC3T3-E1 购于中国科学院细胞库，培养于含有15 %胎牛血清的 DMEM培养基中，在37 ℃、5 % CO2条件下培养。

1.2 方法

1.2.1药物治疗：给予ELP组患者碳酸钙D3咀嚼片(钙尔奇D，600 mg/d，1次/d)、骨化三醇胶丸(罗钙全，0.25 μg/次，2次/d)+口服杜仲腰痛丸(ELP，8粒/次，3次/d，由甘肃省中医院制剂中心提供)，治疗后6个月进行疗效评价。

1.2.2p53过表达载体构建及转染MC3T3-E：根据Gen-Bank中人p53基因序列，选择kana抗性的p53基因过表达载体plRES2-EGFP-p53 WT进行阳性克隆、转染MC3T3-E1细胞(由广州辉骏生物科技股份有限公司完成)。

1.2.3ELP培养液配制及细胞分组：取ELP 20 g(甘肃省中医院制剂室生产)浸泡 24 h，旺火煮沸30 min，取药液2次，混合2次药液，浓缩至20 mL左右。按2∶3 比例加入无水乙醇，静置 24 h。4 000 r/min分别离心55、11 min，取上清液，水浴浓缩蒸发干液体，加蒸馏水配制成2、4、8 g/mL ELP 原药。均用高温消毒30 min，4 ℃冰柜冷藏。取3份20 mL的DMEM培养液，分别加入2、4、8 g/mL杜仲原药4 μL，即得含0.2、0.4和0.8 mg/mL ELP培养液(pH 7.2～7.4，渗透压280～320 mOSM/L)。将细胞分为对照组(无任何处理)、ELP(0.2、0.4、0.8 mg/mL)组、p53过表达组、ELP+ p53过表达组(0.4 mg/mL ELP + p53过表达)。

1.2.4RT-PCR检测：根据北京百奥公司的组织细胞提取试剂盒说明书进行RNA 提取操作。参照Thermo Scientific反转录说明书，合成cDNA。并以双标准曲线的相对定量法进行qPCR定量分析，使用2-ΔΔct法测定p53、ALP、OCN及Runx2 mRNA的相对表达水平，GAPDH为内参。实验设置3个平行复孔，结果取平均值。引物如表1所示。

表1 实验中使用的引物Table 1 Primers used in the experiments

1.2.5Western blot检测：空腹条件下，收集各实验组外周静脉血5 mL，3 000 r/min离心20 min后收集上清，用1×PBS稀释5倍。在16 μL稀释液中加入上样缓冲液4 μL，混匀，在沸水浴中煮5 min，10 000 r/min离心3 min，常温冷却后等体积上样，每孔上样5 μL。用6 % SDS-PAGE凝胶将蛋白分离，恒压电泳，浓缩胶80 mV，分离胶120 mV。PVDF膜电转印，用5 %脱脂牛奶在室温条件下封闭1 h，随后在分别与p53、ALP、OCN及Runx 2(稀释1∶1 000)一抗在4 ℃条件下孵育过夜，再用HRP标记的二抗室温孵育1 h，最后用Image J对条带进行定量分析。

1.2.6骨密度检测：采用美国 LUNADPX - MD型双能X线骨密度分析仪对三组受试者腰椎L2～4、股骨颈(FN)、大转子(GT)、Ward 三角区的BMD进行定量检测。

1.2.7骨代谢生化指标：在空腹条件下，用肝素抗凝采血管收集对照组、OP组及ELP组治疗6个月后的外周静脉血5 mL，用离心机离心，留取血清，用于检测骨钙素(BGP)、骨源性碱性磷酸酶(BALP)及清晨空腹尿酶免法测定尿脱氧吡啶啉/肌酐(DPD/Cr)比值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 杜仲腰痛丸对p53表达的影响

如图1所示，与对照组(control)相比，OP组受试者血清样品中P53基因表达量显著增加(图1 A)，相应地，OP组中p53蛋白的水平也显著增加(图1B)(P<0.01)，表明p53在骨质疏松发展中起着重要作用。杜仲腰痛丸治疗6 个月后，p53的mRNA及蛋白的水平均明显降低(均P<0.01)，提示杜仲腰痛丸可以抑制p53在OP中的表达。

图1 p53的mRNA与蛋白的表达注：A:p53在对照、OP及ELP组治疗后血清中mRNA的水平；B：p53在对照、OP及ELP组治疗后血清中蛋白的水平。与对照组比较，**P<0.01；与OP组比较，##P<0.01。Fig.1 p53 mRNA and protein expression

2.2 杜仲腰痛丸对BMD的影响

如图2所示，与对照组相比，OP组BMD显著降低(P<0.05)，骨量减少。与OP组比较，EPL治疗后腰椎L2～4的BMD显著升高(P<0.01)；而股骨颈(FN)、大转子(GT)及Ward 三角区的BMD值无显著变化(P>0.05)。

图2 腰椎L2～4及股骨颈各部位BMD值的含量注：与对照组比较，*P<0.05,**P<0.01；与OP组比较，##P<0.01。Fig.2 The content of BMD in lumbar spine L2-4 and femoral neck

2.3 骨转换生化指标的比较

如表2所示，与OP组相比，ELP组治疗6个月后受试者的BGP、TRAP及DPD/CR 水平均明显降低，比较差异具有统计学意义(P<0.01)。提示杜仲腰痛丸能更有效地改善老年骨质疏松症的骨代谢水平。

表2 三组受试者BGP、BALP、DPD/CR的比较Table 2 Comparison of BGP,BALP,DPD/CR of three groups

2.4 p53的表达与L2～4BMD、BGP、BALP及DPD/CR含量的相关性

如图3所示，进一步分析发现ELP组治疗后p53的表达水平较OP组显著降低，而L2～4BMD含量显著升高，两者在P<0.01水平上呈显著负相关，同时与骨代谢生化指标BGP、BALP及DPD/CR含量在P<0.01水平上呈显著正相关。相关性分析表明杜仲腰痛丸可能通过抑制p53的表达影响老年骨质疏松症患者的骨密度和骨代谢水平。

图3 ELP治疗后p53的表达与L2～4BMD、BGP、BALP及DPD/CR含量的相关性注：A：与BMD含量的相关性；B与BGP含量的相关性；C：与BALP含量的相关性；D：与DPD/CR含量的相关性。Fig.3 Correlation of p53 expression with L2-4BMD,BGP,BALP and DPD/CR content after ELP treatment

2.5 杜仲腰痛丸对成骨细胞MC3T3-E1中p53表达的影响

如图4所示，与对照组相比，用0.2、0.4、0.8 mg/mL的ELP提取液处理MC3T3-E1 24 h后，MC3T3-E1中p53的表达明显降低，且0.4 mg/mL的ELP提取液对p53的表达影响最为显著(P<0.05)。提示ELP提取液可以抑制MC3T3-E1中p53的表达。

图4 ELP处理后p53的表达水平注：与对照组比较,**P<0.05。Fig.4 p53 expression level after ELP treatment

2.6 杜仲腰痛丸逆转p53过表达对成骨分化的抑制

如图5所示，与p53过表达组相比，杜仲腰痛丸提取液处理的MC3T3-E1中p53的表达明显降低(P<0.05)，见图5 A。此外，与对照组比较，p53过表达显著降低MC3T3-E1中ALP、OCN及Runx 2的mRNA及蛋白表达水平，且0.4 mg/mL的杜仲腰痛丸提取液处理可以逆转p53过表达的影响，显着增加ALP、OCN和Runx 2表达(P<0.05)，见图5B、图5C。提示杜仲腰痛丸提取液可以抑制MC3T3-E1中p53的表达，促进骨形成。

图5 p53、ALP、OCN及Runx 2的表达水平注：A：qRT-PCR检测各组p53表达情况；B、C：qRT-PCR和western blot检测各组成骨基因的表达。与对照组比较,**P<0.01；与p53过表达组比较，##P<0.01。Fig.5 Expression levels of p53,ALP,OCN and Runx 2

3 讨论

骨质疏松症是绝经后妇女和老年人常见的一种广泛的代谢性骨病[10]。骨质疏松症可引起疼痛、脊柱畸形和骨折，甚至可能增加死亡风险[11]。因此，骨质疏松症已成为世界范围内的主要公共卫生问题，给患者和医疗系统带来了沉重的经济负担[12]。故对其治疗及机理的研究显得尤为重要。杜仲腰痛丸是由甘肃中医院研究的经验效方，在治疗OP中具有平衡骨代谢、缓解疼痛、消炎消肿等功效[9]。但是，尚不清楚杜仲腰痛丸对骨骼健康影响的详细机制。

研究[13]发现多种基因参与OP的发病机理。Liu等[14]报道了p53通过miRNA信号通路影响MSC的功能来抑制成骨作用。本研究结果显示，p53 参与OP的发病，且杜仲腰痛丸可以抑制p53的表达影响老年骨质疏松症患者的骨密度和骨代谢水平。

笔者还进行了一项体外研究，结果发现，p53过表达显著降低MC3T3-E1中骨相关基因mRNA以及蛋白的表达水平，但杜仲腰痛丸提取液处理可以逆转p53过表达的影响及ALP、OCN和Runx 2表达(P<0.05)。提示p53过表达抑制骨形成，杜仲腰痛丸提取液可以逆转p53的抑制作用，促进骨形成。相关动物研究[15]也表明下调p53的表达，可以促进骨形成，纠正OP大鼠的骨代谢失衡状态。Wang等[16]的研究表明，p53-/-小鼠的成骨细胞功能增强，呈现高骨量表型，而p53-/-成骨细胞具有增强的促进破骨细胞分化的能力，此外，灭活p53足以挽救在缺乏c-Abl(一种与p53相互作用的蛋白)的小鼠中观察到的成骨细胞分化缺陷。因此，p53是成骨细胞形成、成骨细胞依赖性破骨细胞形成和骨重塑的负调控因子。Fujita等[17]的研究同样表明，p53 基因可以通过影响OPG、RANKL和M-CSF的表达使成骨-破骨失衡。在p53 基因缺陷的成骨细胞中，可以显示出成骨细胞依赖的破骨细胞活性增加。以上研究证实p53 基因对骨形成的抑制作用，与本研究结果一致。

综上所述，本研究结果表明，p53的表达与骨质疏松症的发病进展密切相关，且杜仲腰痛丸可以抑制p53的表达，从而影响老年骨质疏松症患者的骨密度和骨代谢水平。体外研究进一步表明，p53过表达对成骨分化的抑制作用，而杜仲腰痛丸提取液可以逆转p53对成骨分化的抑制作用，促进骨形成，因此可以作为潜在的治疗骨质疏松症药物。当然，本研究还需大量的基础研究、其他研究来比较杜仲腰痛丸及其他药物对骨质疏松症发展的影响。