阿魏酸治疗对去卵巢雌性大鼠骨量流失的保护作用机制研究

胡旭峰

皖南医学院第一附属医院/弋矶山医院，安徽 芜湖 241000

骨质疏松症是一种代谢性疾病，其特征是骨量减少和骨折风险增加，严重影响中老年人的健康[1]。骨吸收和骨形成动态失去平衡是骨质疏松症的根本原因。骨重建是一个生理过程，其中成骨细胞形成新的骨骼，而破骨细胞重新吸收原始的骨基质，对维持成人骨骼健康起到关键作用，多种因素参与调节这一过程[2]。双膦酸盐、雌激素和雷洛昔芬通常用于治疗绝经后骨质疏松症，尽管这些药物可显著增加骨量，但它们具有一些局限性和副作用，包括血栓栓塞和胃肠道刺激[3]。阿魏酸(ferulic acid)是存在于多种水果中的天然多酚类药物，对高血压和胰岛素抵抗有治疗作用[4]。据报道[5-6]，阿魏酸不仅具有抗氧化剂活性，还能抑制成熟破骨细胞的融合和凋亡。有学者还报道[7]了补充阿魏酸可预防链脲佐菌素诱发的糖尿病大鼠脂质过氧化。这些结果显示出阿魏酸可能对绝经后骨质疏松症引起的骨丢失有保护作用。因此，本研究使用去卵巢模型初步探索阿魏酸治疗骨质疏松症的可行性，并研究其作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

选取30只体重220～260 g、3月龄雌性SD大鼠 (购自上海实验动物中心)作为实验动物。每5只大鼠饲养在一个笼子里，光照时间为12 h/d，温度为25 ℃，通风干燥；可以自由饮食，食物是标准大鼠饲料，含有2.5 %酪蛋白、0.8 %磷、1 %钙、70 %～80 %碳水化合物和5 %脂肪。适应1周后，10只大鼠接受假手术(Sham)，其余大鼠行双侧卵巢切除术(OVX)。手术3 d后将大鼠分为3组(每组10只)：Sham组：假手术大鼠，给予生理盐水[(50 mL/(kg·d)]灌胃；OVX组：去卵巢大鼠，给予生理盐水[(50 mL/(kg·d)]灌胃；阿魏酸组：去卵巢大鼠,给予阿魏酸(20 mg/kg，Sigma-Aldrich)灌胃治疗,1次/d，共12周；药物剂量参考文献[7]。治疗结束时通过过量水合氯醛麻醉处死大鼠，获取其双侧股骨行进一步检测。并从大鼠左心室收集血液样本(1 mL/只)，在4 ℃下以2 500 r/min 离心10 min来分离血清样品，置于- 80 ℃下保存，备用。本研究得到皖南医学院第一附属医院伦理委员会的批准(20191211)。

1.2 方法

1.2.1Micro-CT检测：应用Micro-CT CT50成像系统(Micro-CT CT50，Sanco Medical)评价大鼠左侧股骨远端的微观结构。感兴趣体积(VOI)包括从生长板最高点以下2.0 mm到远端100层的骨小梁平扫图片。对VOI区三维图像进行定性和定量分析获取骨体积百分比(BV/TV)、平均骨小梁厚度(Tb.Th)、平均骨小梁数目(Tb.N)、平均骨小梁间距(Tb.Sp)和骨密度(bone mineral density,BMD)。待Micro-CT扫描后，使用10 %乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙，每周更换2次，连续4周，然后用分级乙醇系列(70 %～100 %)脱水。随后进行石蜡包埋，长轴平行于基面。切取厚度为4 mm的纵向连续切片，固定在涂有聚赖氨酸的显微镜载玻片上，进行HE染色。染色方法按照制造商提供的方案进行，并在显微镜(奥林巴斯DP71显微镜，奥林巴斯公司)下检查。

1.2.2血清生化检测：根据制造商提供的方案，使用ELISA试剂盒(目录号F8956和F18955；Westang Biological Technology Co.，Ltd.)检测之前保存的血清样品，检测项目包括P1NP和TRACP-5b在内的骨代谢血清标志物。

1.2.3骨生物力学实验：对大鼠股骨进行三点弯曲以确定股骨最大负荷和刚度。将左侧股骨放在力学测试装置上。将股骨放在支架的中间位置，以10 mm/min的持续测试速度加载直到股骨骨折。记录数据，最后进行分析以获得极限载荷(N)和弹性模量(mm2)。

1.2.4蛋白质印迹检测：将股骨远端在液氮中碎裂，并用放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液裂解。离心后，使用BCA蛋白质测定试剂盒测量上清液中的蛋白质水平。将每种蛋白质样品(60 μg)装入10 %(0.1 g /mL)的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。然后，将膜用5 %(0.05 g/mL)牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭1 h，并与相对应的一抗(BMP-2、Smad1、Smad4、p-Smad1/5/8、GAPDH)在4 ℃下过夜，然后在室温下放置相应的二抗1 h，并用TBST(Tris-HCl 10 mmol/L，氯化钠 150 mmol/L，Tween-20 0.05%(v/v);pH=7.5)洗涤3次。蛋白质表达信号通过增强的化学发光发光液可视化，并使用Tanon系统捕获图像。印迹的灰度值使用ImageJ软件进行检测。

1.3 统计学分析

实验数据表示为均数±标准差。统计分析用SPSS 22.0软件进行。基于方差结果的同质性检验，使用Student’st检验比较两个不同组间差异。以P<0.05判断差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 组织切片分析

股骨干骺端骨小梁的HE染色如图1所示。Sham组显示股骨干骺端骨小梁网状结构正常；OVX组表现为疏松均匀的骨小梁变薄，导致骨小梁间隙变宽；阿魏酸组骨小梁数量和连接增加明显，表现出明显的结构恢复。

图1 三组股骨的组织病理学注：A：Sham组；B：OVX组；C：阿魏酸组。HE染色(放大倍数，×40)。Fig.1 Histopathology of femurs in the three groups

2.2 阿魏酸治疗对大鼠股骨骨小梁结构影响

股骨干骺端骨小梁三维重建图像如图2 A所示。股骨干骺端的微观参数如图2B～图2F所示。OVX组左侧股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th较Sham组明显降低，而Tb.Sp则明显升高(P<0.05)；阿魏酸组左侧股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明显高于OVX组(P<0.05)，而Tb.Sp则明显低于OVX组(P<0.05)。

图2 三组大鼠股骨干骺端Micro-CT检测结果注：A：三组大鼠骨小梁三维重建；B：骨密度；C：Tb.Th；D：Tb.Sp；E：Tb.N;F：BV/TV;a:Sham组;b:OVX组;c:阿魏酸组。与Sham组比较，*P<0.05；与OVX组比较，#P<0.05。Fig.2 Results of Micro-CT in the femoral metaphysis of the three groups of rats

2.3 阿魏酸治疗对大鼠骨代谢指标的影响

阿魏酸治疗对骨转换标志物的影响见图3。与Sham组相比，OVX组P1NP和TRACP-5b水平显著升高(P<0.05)；与OVX组相比，阿魏酸组骨代谢指标P1NP和TRACP-5b水平显著降低(P<0.05)。

图3 阿魏酸治疗对骨代谢指标的影响注：A：P1NP；B：TRACP-5b。与Sham组比较，*P<0.05；与OVX组比较，#P<0.05。Fig.3 Effect of Ferulic acid treatment on the bone metabolism indexes

2.4 阿魏酸治疗对大鼠股骨生物力学的影响

股骨三点弯曲试验如图 4所示，OVX组的极限载荷和弹性模量均显著低于Sham组，两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，阿魏酸组的极限载荷和弹性模量较OVX组明显升高(P<0.05)。

图4 右股骨的三点弯曲试验结果注：A:极限载荷；B:弹性模量。与Sham组比较，*P<0.05；与OVX组比较，#P<0.05。Fig.4 Three-point bending test results of the right femur of rats

2.5 阿魏酸治疗对BMP2/Smads信号通路的影响

与Sham组比较，OVX组BMP-2、Smad1、Smad4、p-Smad1/5/8表达水平明显下调，比较差异有统计学意义(P<0.05)；与OVX组比较，阿魏酸组BMP-2、Smad1、Smad4、p-Smad1/5/8表达水平上调，比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图5 使用WB检测BMP-2、Smad1、Smad4、p-Smad1/5/8和GAPDH的相对表达注：A：各组目标蛋白的表达：B：BMP-2、Smad1、Smad4、p-Smad1/5/8表达；与Sham组比较，*P<0.05；与OVX组比较，#P<0.05。Fig.5 Relative expression of BMP-2,Smad1,Smad4,p-Smad1/5/8 to GAPDH using Western blotting

3 讨论

目前临床上用于治疗绝经后骨质疏松症的药物以双膦酸盐、雌激素受体调节剂或者甲状旁腺素(1-34)为主[8]。尽管这些药物都有一定的疗效，但它们也存在不同程度的局限性。骨质疏松症治疗的目的是恢复骨骼的正常代谢，即增强成骨功能并减少由于骨质疏松症的病理性骨吸收而导致的骨强度降低。OVX大鼠和绝经后女性的雌激素缺乏相似，均出现BMD降低[9-10]。在本研究中，阿魏酸治疗可显著改善BMD，并有效防止OVX诱导的雌激素缺乏引起的骨量流失。

本研究中的生物力学测试表明，与Sham组相比，OVX组大鼠股骨骨折所需的力量较小。阿魏酸治疗显著改善了去卵巢大鼠股骨生物力学性能。骨强度与骨密度、结构、连通性和矿化有关[11]。本研究的结果与以前研究的结果一致，卵巢切除术导致BMD降低以及生物力学强度显著降低[12]。

骨质疏松症的主要原因是骨吸收与骨形成之间的不平衡。健康的骨骼需要保持成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡，以进行适当的骨骼重塑[13]。血清骨代谢指标的变化反映了骨骼代谢的平衡。这些变化可用于评估骨转化，并客观地反映骨吸收和骨形成。TRACP-5b是破骨细胞分泌的细胞因子，在骨重塑中起重要作用。P1NP被认为是骨转换的标志，由成骨细胞分泌，在成骨细胞分化和骨形成活性中起着重要的作用。本研究结果表明，与Sham组大鼠相比，OVX组大鼠的P1NP和TRAP-5b水平显著升高。使用阿魏酸治疗12周后能显著降低P1NP和TRACP-5b水平，表明阿魏酸具有纠正骨吸收与骨形成之间不平衡的能力。

BMPs是转化生长因子β超家族的成员。几项研究[14-15]表明，BMPs可以激活Smad蛋白家族的下游信号分子，刺激间充质细胞分化，并不可逆地诱导骨骼和软骨的形成。BMP-2可通过经典的BMP/Smad途径调节成骨细胞分化。该信号传导途径由II型BMP受体启动，激活后通过磷酸化BMP特异性Smad1、Smad5和Smad8传播BMP信号。然后，p-Smad1/5/8与Smad4结合形成复合物，该复合物易位至细胞核并激活或抑制成骨基因的转录。BMP/Smads信号通路的激活是调控骨髓间充质干细胞成骨分化和抑制破骨细胞介导的骨吸收在骨重塑中的重要调控机制[16]。本研究发现OVX组的BMP-2、Smad1、Smad4和p-Smad1/5/8表达水平较Sham组显著降低，表明OVX组大鼠BMP/Smads信号通路的被抑制，而在经过阿魏酸治疗后，BMP-2、Smad1、Smad4和p-Smad1/5/8较OVX组显著上调，这表明BMP/Smads信号通路已经被激活，最终出现一系列信号传导导致骨代谢失衡纠正，骨量和骨强度增加。

综上所述，本研究表明阿魏酸能够改善去卵巢大鼠的骨量丢失，而这种结果可能是由BMP/Smads信号通路激活而介导的。由于骨质疏松症机制复杂，本研究只是初步证实了阿魏酸具有抗骨质疏松症的潜力，需要进一步扩大样本量和研究时间来证实药物的有效性与安全性。