22C3位点PD-L1与ki67 EGFR和血液指标相关性研究

冒学莲， 王承霞， 陈 艳， 贾张军， 竺明晨

(南京医科大学附属肿瘤医院/江苏省肿瘤医院/江苏省肿瘤防治研究所， 江苏 南京 210009)

近年来，肺癌发病率及致死率逐年上升，跃居首位，成为肿瘤患者的“第一杀手”，非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)占原发性肺癌的80%。为了延长患者生命，提高生存率以及改善预后，NSCLC非手术性治疗，渐渐从靶向在向免疫治疗方向发展，由NSCLC晚期的标准二线治疗，转变为无驱动基因改变，PD-L1高表达的一线治疗，改变的治疗策略，开启了肺癌新时代的精彩篇章。PD-L1通过诱导T细胞凋亡，抑制细胞因子表达，传递共刺激信号通路，减少细胞免疫应答，降低机体对肿瘤细胞的监视和清除，肿瘤由此发生、发展。多篇文献指出PD-L1的过表达与较差的临床指标相关[1]。PD-L1高表达可能成为预测肺癌患者预后的潜在标志物[2]，研究NSCLC患者PD-L1的表达情况与患者的临床病理特征、ki67、EGFR预后有关因素之间的相关性，对NSCLC患者的治疗与预后将产生重要的影响。

1 材料与方法

1.1一般资料:收集江苏省肿瘤医院2018年11月至2019年7月的临床病理资料完整的，且经病理学确诊为NSCLC组织标本121例。男性91例，女性30例。年龄37～90岁，中位年龄63岁。60岁以下的占33.1%。73.6%(89/121)的患者有淋巴结转移。14.9%(18/121)的患者有时吸烟，85.1%的患者从不吸烟。根据2016年国际抗癌联盟(UICC)新的修订标准，进行NSCLC的TNM分期[12]，其中Ⅰ～Ⅱ期18例，Ⅲ～Ⅳ期103例。腺癌76例，其他45例为鳞癌、腺鳞癌，神经内分泌癌等。分化程度：高分化11例、中分化34例、低分化76例；病人血液检验结果均为入院采血第一次所得。研究获得本院医学伦理委员会的批准。

1.2组织标本免疫组化:4μm石蜡切片，二甲苯脱蜡至水、2min高温高压抗原修复、3% H2O2进行封闭，按照北京中杉金桥生物技术有限公司公司试剂盒说明书进行分别加入一抗Ki67工作液和单克隆鼠抗人PD-L1(22C3)，封片均设阳性和阴性对照，阴性对照为PBS代替一抗。在对应的DAKO Link 48诊断平台，PD-L1染色结果判定根据肿瘤细胞(TC)呈现任何强度细胞膜染色(PD-L1)的占比，<1%为阴性；1～49%为低表达；≥50%为高表达。所有切片均由经验丰富的病理诊断医生，至少2名进行切片判定。

1.3EGFR基因突变的检测:采用EGFR基因突变检测试剂盒(ARMS法)，检测EGFR基因18、19、20、21外显子突变，严格参照说明书进行操作，检测结束后分析结果。

1.4血清各项指标检测:清晨抽取所有受试者，空腹静脉血5mL于试管中，混匀备用。采用emiBioCytoCounter系列全自动可视化细胞检测仪检测CD3+,、CD4+、CD8+T细胞比例。采用罗氏全自动生化分析仪P800和电化学发光免疫分析仪E601及配套试剂分别检测血清LDH、CEA、CA199、CY211水平。严格参照操作流程进行操作。

1.5统计学处理:研究所得数据录入SPSS20.0进行统计，计数资料用率(%)表示，组间比较采用χ2检验，Spearman进行相关性分析。所有统计结果，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1PD-L1与各指标阳性表达率:所有患者均行PD-L1检测。PD-L1阳性表达率分别为61.2%(74/121)，低表达率38.0%(46/121)高表达率23.2%(28/121)。101例患者进行Ki67免疫组化，Ki67高表达占56.4%(57/101)。48例患者进行了EGFR基因检测，其中阳性突变者占41.7%(20/48)。119例患者行CEA检测，异常率为64.7%(77/119)。108例患者行CA125检测，异常率为51.9%(56/108)。119例患者行LDH检测，异常率为17.6%(21/119)，71例患者行CY211检测，异常率为64.8%(46/71)。见表1。

表1 肺癌各项指标的异常(高)表达率

2.2PD-L1表达与肺癌的临床病理特征的关系:Ⅲ+Ⅳ分期和局部有淋巴结转移的患者PD-L1阳性表达率显著高于Ⅰ+Ⅱ和无淋巴结转移的患者，差异具有统计学意义(χ2=6.636、7.726，P<0.05)，不同年龄、性别、病理类型、吸烟情况、分化情况，PD-L1阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 PD-L1表达与肺癌的临床病理特征的关系n(%)

2.3EGFR、免疫组化与血清各项指标的对PD-L1阳性表达率相关性:PD-L1阳性表达率与EGFR突变型、Ki67高表达、CD8+T细胞数量增高和LDH增高具有显著相关性。呈正相关(P<0.05)，而与CY211增高、CEA增高和CD4+T细胞数量异常未见明显相关性(P>0.05)。见表3。

表3 PD-L1表达与肺癌的其他指标的相关性(n)

3 讨 论

PD-L1是定位于人染色体9q24，编码290个氨基酸的穿膜蛋白，表达于大部分肿瘤细胞及免疫细胞表面，巨噬细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞[3]。PD-1/ PD-L1是近年来研究较热的负性免疫共刺激分子，抑制细胞因子的转录和翻译，抑制了肿瘤特异性CD8+T细胞的免疫活性，诱导T细胞凋亡，从而逃避T细胞的抗肿瘤免疫应答，进而促进肿瘤形成。PD-1与PD-L1在实体恶性肿瘤的发生、发展中发挥重要的生物学作用[2]。本研究PD-L1阳性表达率为61.2%，略高于Lin[4]等研究，PD-L1在肺癌肿瘤细胞上高表达53.6%，差异可能与研究对象选择不同有关。

本文研究结果显示，Ⅲ+Ⅳ分期和局部有淋巴结转移的患者PD-L1阳性表达率显著增高。与Koh等报告相吻合[5]，肺腺癌中PD-L1与TNM临床分期呈正性相关。在NSCLC中，PD-L1与PD-1结合后，调节肿瘤微环境，降低CD8+T细胞的糖酵解，抑制活化增殖，逃避监视和杀伤，导致患者病情进展、淋巴结转移，分期高，迅速恶化[6]。PD-L1与肺癌病情发展和转移存在相关性，肺癌分期较高患者中PD-L1表达水平更高，肿瘤细胞高表达PD-L1提示侵袭性高、分期较晚。

本研究中高表达PD-L1与部分免疫组化分子、血液分子物质具有显著相关性，如LDH、EGFR基因突变、Ki67表达和CD8+T细胞。与诸多研究结果相一致。Tang等[7]发现晚期肺腺癌中PD-L1高表达，EGFR突变型PD-L1高表达率显著提高71.9%；TKIs治疗EGFR突变型高表达PD-L1患者预后更好。Reck[8]and Rittmeyer[9]研究发现EGFR突变患者其免疫治疗，疗效显著差于EGFR野生型。EGFR属于肺癌的驱动基因，原癌基因的激活和抑癌基因的失活，免疫微环境细胞因子诱导，导致细胞的分化、增殖、凋亡发生异常，高增殖率，高异质性的肺癌发生，EGFR调控信号通路，持续激活诱导肿瘤细胞PD-L1非炎症性机制表达，同时促进PD-L1糖基化水平,而不被降解，起稳定PD-L1分子的作用。TKI在直接抗肿瘤的同时，还可以间接抗肿瘤，通过下调PD-L1表达、增强细胞免疫应答。分析EGFR与PD-L1间的分子联系，对肺癌免疫治疗和靶向治疗的规范应用，有很大的导向作用。

Ki-67高表达与PD-L1表达具有明显相关性，Ki-67是一种与细胞周期相关的蛋白质，被认为是肿瘤细胞增殖相关的核标记物[10]。在肺癌的预后研究中，Ki-67影响着治疗疗效，可作为预后差的标志物，在肺癌的免疫逃逸过程中，PD-L1表达高者，肿瘤细胞加速增殖，迅速恶化[11]，提示PD-L1高表达者，病情重，发展快。

LDH是乳酸脱氢酶，是个常规生化指标，肺癌患者中LDH升高者，PD-L1表达率显著升高。美国AACR在2016年发布，在使用抗PD-L1抗体治疗肿瘤时，LDH值正常的患者，肿瘤控制率显著高于LDH值增高的患者。肿瘤细胞在侵袭发展的过程中，正常细胞破裂死亡，释放出LDH，PD-L1越高，提示恶性程度越高，侵袭力强，LDH值越高，因此PD-L1可能成为肺癌患者生存的预测生物标志物。

近年来,以PD-L1/PD-1抑制剂为代表，现在已有鼠来源的22C3，获得美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)通过，并获得认证，可以应用于临床，用于非小细胞肺癌的伴随诊断，筛选癌症新药Pembrolizumab单抗，增强机体内源性抗肿瘤效应。肿瘤免疫疗法为无法手术，或转移的晚期非小细胞肺癌患者带来新的希望。SUN等[12]研究Ⅰ期患者PD-L1高表达患者的复发率显著提高，ⅢB/Ⅳ期NSCLC患者PD-L1表达强阳性与OS较短相关。Madore[13]等研究提示，PD-L1蛋白表达提示较差的预后。深入研究PD-L1在NSCLC的表达情况，及相关分子显得尤为重要。PD-L1与NSCLC病情发展和转移存在相关性，抑制T细胞的活化增殖，进而导致病情进展或转移，可作为病情程度的判断指标。

本研究存在一些局限性，回顾性分析，样本量不够大，所选择的患者不是有全部的临床资料，进行了EGFR检测患者数量有限，只分析了组织石蜡切片的结果，未对血液结果同步分析；肿瘤个体异质性，导致数据统计结果会有所偏差；仅选用22C3一种抗体检测PD-L1表达情况，没有涵盖多种抗体检测结果，免疫法判定也易受多种因素影响，不能做到标准化；缺乏患者使用Pembrolizumab治疗疗效的相关数据。随着抗PD-1/PD-L1免疫治疗的临床应用，PD-L1与TNM分期淋巴结转移CD8+T细胞、LDH和Ki67表达之间关系，尤其是与EGFR等肺癌驱动基因信号通路之间的联系，进一步分析PD-L1表达在NSCLC患者中的预后意义，有助于靶向治疗与免疫治疗的在个体化，精准化治疗手段中更加合理地规范使用，最终将肺癌的治疗过程向慢性病迈进。