Cx43介导GJIC与mTOR在胃癌组织中表达及意义

刘 欢， 赵 杨， 申兴斌， 刘莎莎

(承德医学院附属医院病理科， 河北 承德 067000)

在我国，胃癌的发病率及死亡率排名第二位，以中老年男性多见[1]。临床上胃癌以中晚期患者多见，传统治疗以手术治疗为主，化疗药物为辅，多种靶向药物治疗胃癌处于临床试验中，但治疗效果有待提高，因此研究胃癌潜在的治疗靶点尤为重要[2]。连接蛋白43(Connexin43，Cx43)是细胞间隙连接(gap junction intercellular communication，GJIC)的重要组成连接蛋白之一，Cx43介导的GJIC广泛存在于正常细胞膜上，是连接细胞与细胞间的信号传导跨膜通道。其组成的通道使<1000kDa分子通过，从而调控细胞增殖、分化，稳定细胞内环境等。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin mTOR)是PI3K/AKT/mTOR信号通路的重要下游蛋白分子，处于整个信号通路的中心位置，影响下游p70或4E-BP1的转录。参与基因转录翻译、核糖体生成及细胞凋亡等过程，在肿瘤增殖和侵袭中起重要作用[3,4]。在胃癌的发生发展过程中，Cx43与mTOR的表达情况是否存在一定的关联尚未见报道，值得进一步探讨。本研究通过运用免疫组化和qRT-PCR的实验方法检测Cx43及mTOR蛋白和mRNA的表达情况，探讨其与胃癌病理特征参数的相关性，探索胃癌的发生、发展机制，为寻找潜在治疗靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1材料:收集2019年2月至9月承德医学院附属医院经根治性手术切除的新鲜胃癌患者标本60例，术前均未行放化疗及免疫治疗，所有标本均经病理证实为胃腺癌。留取胃癌组织及正常胃黏膜组织(距癌灶至少5cm以上)，一部分新鲜组织立刻放置-80℃超低温冰箱保存用于qRT-PCR实验，另一部分组织制成蜡块切片进行免疫组化实验。60例胃癌患者中男性53例，女性7例，年龄在39～85岁，<60岁28例，≥60岁32例；高中分化15例，低分化45例；TNM分期(根据AJCC/UICC胃癌TNM分期第八版)I～II期21例，III～IV期39例；无淋巴转移25例，有淋巴转移35例；≤深肌层9例，>深肌层51例。

1.2免疫组化

1.2.1方法:所有标本固定后，常规脱水、包埋，5μm切片，烘烤，常规脱蜡复水，抗原修复，去酶，封闭，滴加Cx43(抗体浓度为1∶150)、mTOR(抗体浓度为1∶150)及PBS做阴性对照，二抗IgG，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，DAB显色。

1.2.2判读标准:Cx43、mTOR抗体表达阳性着色分布于细胞膜或细胞质，呈棕黄色颗粒，随机选择5个高倍视野(×400)，采用双盲法按阳性细胞百分比(A值)及染色强度(B值)进行评分。A值：阳性细胞所占平均百分比评分：≤5%记0分；>5%～25%记1分；>25%～50%记2分；>50%记3分。B值：染色强度评分：未着色记0分；淡黄色记1分；黄色记2分；棕黄色记3分。A+B为总分：总分0分为阴性(-)；1～2分为弱阳性(+)；3～4分为中等阳性(++)；5～6分为强阳性(+++)。以-～+为低表达(阴性)，++～+++为高表达(阳性)。

1.3qRT-PCR

1.3.1方法:①取上清液：取20mg新鲜胃癌组织及正常胃黏膜组织，用500ul Buffer RL1将组织匀浆，收集上清液，并用DNA-cleaning column去除DNA，离心13,400×g，2min(收集滤液，转移至新离心管中)。②调整上柱体系：每500ul滤液内添加800uL Buffer RL2，用RNA-only Column 特异性吸附RNA，离心13,400×g ，1min。③洗涤：用500uL Buffer RW1 去蛋白(13,400×g ，1min)，再用700uL Buffer RW2 洗涤2次脱盐，(13,400×g ，1min)。④离心：去除残留乙醇13,400×g ，2min。⑤洗脱提取RNA：50ulRNase-Free ddH2O 13,400×g ，1min。⑥按反转试剂盒说明在200ul无酶EP管内构建20μl反转体系5×ABScript II RT Mix 4uL ，总RNA 1pg-1ug，Nuclease-free H2O补足至 20μL；温度设置：25℃ 5min→42℃ 15min→85℃ 5sec→12℃ Hold。⑦扩增：2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mi 10uL，上下游引物2ul，cDNA模板2ul，RNase Free dH2O 6ul，共20uL反应体系；反应温度设置：95℃ 3min，1 cycle→95℃ 5 s+60℃ 30 s，40 cycles。

1.3.2结果:实验得到的Ct值，以2-ΔΔCt来表示目的基因的相对表达量。

2 结 果

2.1Cx43及mTOR在胃癌组织及正常胃黏膜组织中蛋白及mRNA表达比较。

2.1.1免疫组化显示：Cx43及mTOR蛋白的阳性表达在细胞膜或细胞质中(见图1，图2)。Cx43蛋白在胃癌组织中阳性表达率(41.7%，25/60)明显低于正常胃黏膜组织(86.7%，52/60)(P<0.01)，见表1，mTOR蛋白阳性表达率(83.3%，50/60)则明显高于正常胃黏膜组织(43.3%，26/60)(P<0.01)，见表1。

表1 免疫组化Cx43及mTOR在不同胃组织中蛋白表达比较

图1 Cx43在胃癌和正常胃黏膜组织中的表达

图2 mTOR在胃癌和正常黏膜组织中的表达

2.1.2qRT-PCR实验显示：Cx43在胃癌组织中mRNA表达量(0.57±0.11)低于正常胃黏膜组织中mRNA表达量(1.00±0.00)；mTOR在胃癌组织中mRNA表达量(1.87±0.28)高于正常胃黏膜组织中mRNA表达量(1.00±0.00)(均P<0.01)，见图3。

图3 Cx43及mTOR在胃癌组织和正常胃黏膜组织中mRNA 的表达

2.2 在胃癌组织中Cx43、mTOR蛋白和mRNA表达与临床病理参数之间的关系:在恶性程度为高中分化，TNM分期为I和II期，浸润未超过深肌层及无淋巴转移及的胃癌组织中Cx43蛋白表达量比恶性程度为低分化，TNM分期为III和IV期，浸润超过深肌层及伴淋巴转移的胃癌组织高；在恶性程度为高中分化，TNM分期为I和II期，浸润未超过深肌层胃癌组织中mTOR蛋白表达量比恶性程度为低分化，TNM分期为III和IV期，浸润超过深肌层的胃癌组织低；差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表2。

表2 Cx43及mTOR蛋白表达与胃癌临床病理参数的关系

Cx43 mRNA的相对表达量在TNM分期为I和II期(0.67±0.05)比III和IV期(0.52±0.09)高，浸润未超过深肌层(0.64±0.06)比浸润超过深肌层(0.56±0.11)高，无淋巴转移(0.64±0.07)比伴淋巴转移(0.53±0.10)高，高中分化(0.63±0.08)比低分化(0.55±0.11)高，差异均有统计学意义(均P<0.05)。胃癌组织mTOR mRNA相对表达量则与之相反，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表3。

表3 Cx43及mTOR mRNA表达与胃癌临床病理参数的关系

3 讨 论

GJIC是连接细胞间的信息传导的特殊膜结构，目前发现组成GJIC的连接蛋白(Connexin，Cx)有21种，但Cx43介导的GJIC与肿瘤关系最为密切，研究热点也围绕于此。Cx43在正常组织中广泛表达在细胞膜上[5]。本研究发现Cx43在正常胃黏膜细胞膜表面广泛表达，在胃癌组织细胞膜或细胞质中表达减少或缺如，表明Cx43可能参与胃癌的发生发展，其致癌机制可能是Cx43在胃癌组织中表达减少，使Cx43介导的GJIC功能下降，使细胞间传递细胞增殖和分化的信号受阻，导致胃癌的发生。张立伟[6]等的研究亦支持这一观点。本研究进一步发现随着胃癌组织恶性程度的增加、临床分期越晚、浸润程度越深及淋巴转移，Cx43表达逐渐减少甚至缺如。同时li[7]等人在显微镜下观察到Cx43介导的GJIC膜结构在胃癌组织中随着恶性程度的增加间隙连接结构遭到破坏越严重。结合文献[8]说明Cx43与胃癌的发生发展有关，且参与了胃癌的侵袭及转移。以上结论说明Cx43作为治疗胃癌的潜在靶点提供了有效的理论依据。

mTOR是一个长度为289kDa的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于PIKK家族成员。其下游蛋白以4E-BP1和p70S6K为最主要，mTOR介导的下游通路主要功能是促进蛋白翻译过程，加快蛋白合成。本实验研究显示：在胃癌组织中mTOR表达量均比正常胃黏膜组织表达量高。随着胃癌组织恶性程度的增高、临床分期越晚、浸润深度越深，mTOR的表达量越高，结合文献[9]推测mTOR在胃癌组织中过度激活，其相关信号通路则过度激活，促进细胞增殖、血管形成、抑制细胞凋亡及自噬。以上研究结果说明mTOR在胃癌中的异常激活，参与胃癌的侵袭及转移机制。

本研究相关性分析显示在胃癌组织中Cx43及mTOR蛋白及mRNA表达均呈负相关。所以我们推测可能在基因水平Cx43的表达下降，使Cx43蛋白表达下降导致Cx介导的GJIC功能抑制或缺陷，从而使细胞间的信号传导功能减弱，可能使细胞内mTOR mRNA翻译活性的增强，使胃癌细胞蛋白质合成增加，抑制细胞凋亡，加快细胞周期的运行，促进肿瘤血管形成和侵袭转移。目前有临床试验应用抗mTOR靶向药物治疗胃癌，但胃癌晚期患者的中位生存期及肿瘤控制率未显示出该药物的有效性[10,11]。可能是因为雷帕霉素及其类似物通过负反馈引起AKT过度活化，减弱了其抗肿瘤作用，限制了抗mTOR靶向药物治疗的作用，故需要研究多个位点联合靶向治疗胃癌。总之，Cx43及mTOR在胃癌组织中存在异常表达，表示可能参与了胃癌的发生发展机制，两者在胃癌的演进过程中起拮抗作用，Cx43可能是胃癌治疗潜在作用靶点，与mTOR靶点联合治疗胃癌成为可能，但具体机制有待进一步研究。