枇杷酵素自然发酵过程中有机酸及其抗氧化活性的研究

付龙威，汤晓娟，林祥娜，张艳珍，刘云国*

（1.新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046；2.临沂大学生命科学学院，山东 临沂 276000）

枇杷[Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl]属蔷薇科植物，其花、果、叶均可入药。成熟枇杷鲜果不仅酸甜可口、营养丰富，具有止咳润肺、消炎镇痛、延缓衰老等生理功效[1]；还具有抗动脉硬化、抗血栓、抗胃溃疡、抗菌、抗突变的生物活性及皮肤保健和美容等功效[2]，是进行果蔬深加工的良好原料。枇杷是一种季节性水果，应季的时候产量较大，且不耐储存和运输，极易变质[3]。因此解决枇杷短期量大的问题备受关注。

目前枇杷果实除鲜食外，其加工产品仍然以果汁、罐头、果酱以及干制为主，少量的枇杷酒及醋饮料[4-5]，枇杷的深加工及其综合利用还有待加强，目前尚未见枇杷酵素的报道。食用植物酵素（edible plant enzyme）是以新鲜蔬菜、水果、药食两用本草类为原料，经多种有益菌通过较长时间发酵而生产的功能性发酵产品。研究表明，酵素可有效地清除体内过剩的自由基，在预防和治疗因自由基诱发的疾病和抗衰老方面具有广阔的应用前景[6-7]。目前酵素品类繁多，但品质差别大，且相关科学研究支撑不足，亟需深入开展酵素发酵过程功能组分和功效研究，进而用标准化手段规范传统工艺，保证酵素品质。

本研究以枇杷酵素为研究对象，通过测定枇杷自然发酵过程中pH值、可滴定酸、有机酸、总酚含量变化来分析枇杷发酵过程中活性成分的变化；以DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、羟基自由基清除能力和超氧阴离子自由基清除能力为抗氧化性指标，评价枇杷酵素的抗氧化活性，为枇杷酵素的综合开发提供相关理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枇杷：采自莆田地区；白砂糖（食品级）：上海怡神保健食品有限公司；标准品没食子酸：上海源叶生物科技有限公司；乳酸、乙酸、无水酒精、无水亚硫酸钠、氢氧化钠、水杨酸钠、硫酸亚铁、焦性没食子酸、过硫酸钾、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾（均为分析纯）：天津凯通化学试剂有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；邻苯三酚，2，2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、1，1-二苯基-2-苦苯肼（DPPH）（均为分析纯）：北京谨明生物科技有限公司；福林酚（10%）溶液：北京索莱宝生物科技有限公司；浓盐酸、浓硫酸、过氧化氢（均为分析纯）：烟台远东精细化工有限公司。

1.2 仪器与设备

1200高效液相色谱仪：美国Agilent公司；WT-B千分之一分析天平：杭州万特衡器有限公司；SHZ-S（Ⅲ）循环水式多用真空泵：上海力辰邦西仪器科技有限公司；BEST超纯水机：上海芷昂仪器有限公司；DZF-6094真空干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；Mikro-220R离心机：德国Hettich科学仪器公司；752紫外分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；DW-86L626海尔超低温冰箱：青岛海尔股份有限公司；Eppendorf移液枪：德国艾本德股份公司；PHS-3C雷磁pH计：上海雷磁仪器厂；HWS-24型电热恒温水浴锅：上海资一仪器设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 枇杷酵素的制备

无菌水清洗枇杷2遍～3遍，于超净台晾干，切片、去除核，枇杷∶糖（1∶1，质量比），加入无菌水，25℃左右自然发酵，pH值在3～4之间发酵结束。定期取样，将样品离心后的上清液保存于-80℃超低温冰箱中待测。

1.3.2 pH值和可滴定酸的测定

使用精密pH计测定酵素样品的pH值。

可滴定酸含量的测定方法参考文献[8]，结果以乳酸质量浓度（g/100 mL）计。

1.3.3 酵素中有机酸含量的测定

待测样品用去离子水稀释5倍，用0.22 μm微孔滤膜过滤，利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测定酵素中的有机酸含量。色谱条件：色谱柱为Aminex@HPX-87H Exclusion Column柱（300 mm×7.8 mm），流动相为0.275%（体积比）的浓硫酸溶液，流速0.4 mL/min，柱温40℃，进样量10 μL，检测波长210 nm。

1.3.4 总酚含量的测定

总酚含量的测定方法参考文献[9]。

1.3.5 DPPH自由基清除能力的测定

DPPH自由基清除能力的测定方法参考文献[10]。

1.3.6 ABTS+自由基清除能力的测定

ABTS+自由基清除能力的测定方法参考文献[11]。

1.3.7 羟基自由基清除能力的测定

羟基自由基清除能力的测定方法参考文献[12]。

1.3.8 超氧阴离子自由基清除能力的测定

超氧阴离子自由基清除能力的测定方法参考文献[13]。

1.3.9 综合评价指标分析

综合评价指标分析的测定方法参考文献[8]。

1.4 数据处理

每组试验均重复3次，采用origin 9.1进行绘图，结果以平均值±标准差表示，SPSS 25软件进行单因素方差分析、相关性分析和主成分分析，当P＜0.05表示在统计学上具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 枇杷酵素发酵过程中pH值与可滴定酸的变化

枇杷发酵过程中pH值和可滴定酸含量的变化如图1所示。

图1 发酵过程中pH值和可滴定酸含量的变化Fig.1 Changes in pH value and total titratable acidity during the enzyme fermentation

由图1可知，pH值和可滴定酸含量在发酵过程中呈现相反的变化趋势。pH值在50 d内由（4.920±0.130）迅速下降至（3.37±0.017）（P＜0.05），后缓慢上升直至稳定于3.5左右。发酵过程中，可滴定酸在50 d达到最大值，由（0.048±0.026）g/100 mL 上升至（0.315±0.022）g/100 mL（P＜0.05），50 d 后有所下降并保持平稳（P＞0.05）。发酵前期可滴定酸含量的快速上升是由于自然发酵过程微生物代谢产生的醋酸、乳酸等多种有机酸所致[14]。发酵50 d后可滴定酸含量下降可能是因为酵母菌等微生物降解部分有机酸，导致乳酸、乙酸含量下降[15]。

2.2 酵素发酵过程中有机酸含量的变化

自然发酵酵素中酵母菌、醋酸菌和乳酸菌是最常见的微生物[16]。有机酸标准曲线见表1。枇杷酵素中乳酸和乙酸含量的变化如图2。

表1 有机酸标准曲线Table 1 Standard curves of organic acids

图2 发酵过程中乳酸和乙酸含量的变化Fig.2 Changes in lactic acid and acetic acid contents during the enzyme fermentation

发酵过程中乳酸和乙酸含量呈先上升后下降的趋势。乳酸在第5天没有检测出，10 d～20 d由（0.33±0.02）mg/mL 增长到（1.82±0.68）mg/mL，增幅达451.52%（P＜0.05），20 d以后缓慢增加，在第40天达到最大值（2.09±0.05）mg/mL。乙酸在前20 d增加且第20天达到最大值（2.67±0.65）mg/mL（P＜0.05），之后缓慢下降至（1.48±0.03）mg/mL。枇杷酵素中的有机酸除植物材料中固有有机酸溶出外，主要由发酵过程中大量繁殖的产酸微生物代谢生成，而发酵后期有机酸减少可能一方面由于糖类物质消耗，微生物利用有机酸作为碳源，或较低pH值抑制部分微生物生长，导致有机酸含量略有下降[17]，另一方面可能因为在微生物的作用下消耗有机酸和单糖产生芳香味的酯类有关。20 d～40 d之间，乙酸缓慢减少，乳酸缓慢增加可能因为乳酸菌通过糖代谢生成乳酸，在厌氧条件下还可将乳酸氧化转化为乙酸[18]。

2.3 酵素发酵过程中总酚含量的变化

酚类物质具有较强的抗氧化活性。以没食子酸为标品，标准曲线为Y=0.001 3x-0.026 5，R2=0.999 6。酵素发酵过程中总酚含量变化如图3所示。

发酵前15 d，总酚含量缓慢上升，可能与发酵前期枇杷在高渗透压的环境中多酚类物质溶出有关。发酵20 d～30 d总酚含量快速上升（P＜0.05），于 30 d达到最大值（2.08±0.06）mg/mL，这可能与随着发酵的进行，在微生物作用下，单体酚类物质的合成所致[19]。30 d后总酚含量降低（P＜0.05），可能是由于在发酵过程中多酚氧化酶被活化，促进多酚发生氧化生成褐色物质[20-21]，颜色加深；小分子的酚类物质被微生物降解[22]。

图3 发酵过程中总酚含量变化Fig.3 Changes in total phenolic content during the enzyme fermentation

2.4 酵素发酵过程中DPPH自由基清除率的变化

DPPH是一种很稳定的自由基，被广泛用于判断抗氧化剂的清除自由基能力[23]。枇杷酵素发酵过程中DPPH自由基清除率的变化如图4所示。

图4 发酵过程中DPPH自由基清除能力变化Fig.4 Changes in DPPH free radical scavenging ability during the enzyme fermentation

发酵过程中DPPH自由基清除率呈先上升后下降的趋势。枇杷酵素的DPPH自由基清除率在5 d～20 d之间由（32.88±2.08）%迅速上升至（87.45±1.20）%（P＜0.05），增幅达到165.97%，20 d～40 d之间变化幅度较小（P＞0.05），并于发酵 30 d时达到最高的（87.54±1.2）%，40d以后清除能力下降。研究表明随着时间延长DPPH自由基清除率呈快速上升后缓慢下降的趋势[24]。

2.5 酵素发酵过程中ABTS+自由基清除率的变化

枇杷酵素发酵过程中ABTS+自由基清除率的变化如图5所示。

发酵过程中ABTS+自由基清除率呈迅速上升后下降的趋势。发酵前25 d，ABTS+自由基清除率从（45.00±0.48）%快速上升至（91.93±0.65）%（P＜0.05），增幅达到104.29%。随后清除率下降，并于第60天降到（57.99±4.81）%（P＜0.05），随后又上升。本研究结果与百合酵素清除ABTS+自由基的变化相似[25]。贾仕杰等[26]研究表明酚类物质与ABTS+自由基的清除能力具有显著的正相关性。

图5 发酵过程中ABTS+自由基清除能力变化Fig.5 Changes in ABTS+free radical scavenging ability during the enzyme fermentation

2.6 酵素发酵过程中羟自由基清除率的变化

羟自由基是氧自由基中最为活泼的自由基，过量的羟自由基会引起生物分子的严重损伤。枇杷酵素发酵过程中羟自由基清除率的变化如图6所示。

图6 发酵过程中羟自由基清除能力变化Fig.6 Changes in hydroxyl free radical scavenging ability during the enzyme fermentation

发酵过程中羟自由基清除率呈先上升后下降并趋于稳定的趋势。发酵前40 d，羟自由基清除率从（17.17±0.48）%快速上升至（52.09±0.65）%（P＜0.05），增幅达203.38%，随后清除率下降至（35.96±0.2）%（P＜0.05）。羟基自由基清除能力的提高可能是由于酵素中多种有机酸综合作用的结果[26]；也有研究表明酵母壁上的多糖具有一定的羟基自由基清除能力[27]；酚类物质具有较强的羟自由基的清除能力[28]。

2.7 酵素发酵过程中超氧阴离子自由基清除率的变化

超氧阴离子自由基在活性氧物质的形成中起重要作用，主要损害细胞膜[29]。枇杷酵素发酵过程中超氧阴离子自由基清除率的变化如图7所示。

发酵过程中超氧阴离子自由基清除率呈先上升后下降的趋势。发酵前 50 d，由（12.90±0.10）%上升至最高（49.7±0.65）%（P＜0.05），增幅达 285.27%，随后清除率下降。酚类物质具有清除超氧阴离子自由基能力[29]，超氧阴离子自由基清除能力与酚类物质变化趋势一致，与蒋增良等[30]研究的葡萄酵素自然发酵过程中对超氧阴离子自由基的清除能力的趋势相似。

2.8 相关性分析

根据Pearson相关分析结果见表2。

枇杷酵素发酵过程中4种体外抗氧化性指标均与总酚含量呈显著正相关（P＜0.05），其中与DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力和超氧阴离子自由基清除能力呈极显著正相关（P＜0.01）；乳酸与4种体外抗氧化性呈极显著关系（P＜0.01），乙酸与DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力呈极显著正相关（P＜0.01）。说明酵素中的酚类物质和有机酸具有一定的抗氧化性作用。

图7 发酵过程中超氧阴离子自由基清除能力变化Fig.7 Changes in superoxide anion free radical scavenging ability during the enzyme fermentation

表2 枇杷酵素各参数相关分析Table 2 Correlation analysis of various parameters loquat enzyme

表3 主成分的特征值、贡献率和累积贡献率Table 3 The eigenvalue，contribution rate and the cumulative contribution rate of principal components

2.9 主成分分析

为了进一步明确枇杷酵素中各变量之间的相互关系，通过主成分分析对各变量进行降维处理。枇杷酵素主成分的特征值、贡献率和累积贡献率见表3。旋转载荷见表4。

以特征值1.0为纳入标准，优化出2个主成分。枇杷酵素的第 1主成分（principal component 1，PC1）贡献率为63.694%，第2主成分（PC2）贡献率为23.125%，前2个主成分的累积贡献率为86.819%，符合主成分分析的要求。PC1反映了pH值、可滴定酸、总酚、乳酸、羟基自由基清除率和超氧自由基清除率的变异信息，PC2反映了乙酸、ABTS+自由基清除率和DPPH自由基清除率的变异信息。通过主成分分析对原先的9种变量指标进行处理后获得F1、F2两个新变量，通过公式计算综合评价指标（comprehensive evaluation indexes，CEI），CEI=（5.732F1+2.081F2）/（5.732+2.081）。

表4 旋转载荷Table 4 Rotation component matrix

不同时间枇杷酵素的CEI值如图8。

图8 枇杷酵素发酵过程中综合评价指标图Fig.8 Comprehensive evaluation index of loquat enzyme during fermentation process

发酵第5天时CEI值最低为-1.774，发酵第40天时CEI值最高为0.909。发酵前25 d，CEI值快速上升；发酵25 d～40 d，CEI值较为稳定；发酵40 d以后，CEI值逐渐下降。因此可判断枇杷酵素的发酵终点为40 d。

3 结论

本文采用不同的自由基体系和Pearson相关分析对枇杷酵素体外抗氧化活性进行了较为全面的研究。从试验结果可以看出，枇杷酵素对ABTS+自由基和DPPH自由基具有很强的清除作用，并对羟自由基和超氧阴离子自由基也有一定的清除作用，这表明枇杷酵素能够清除体内多余自由基，具有较好的抗氧化能力。枇杷酵素中富含的乳酸、乙酸和多酚类化合物等活性成分，具有良好的抗氧化活性。综合考虑时间成本与CEI值，发酵至40 d时CEI值达到最大，因此确定枇杷酵素的发酵终点为40 d。