RNA干扰Geminin基因表达对脑胶质瘤恶性生物学行为的影响

王 燕，田 薇，章建国，刘益飞，靳 钦

南通大学附属医院病理科，江苏 南通 226001

胶质瘤是目前最常见的恶性原发性脑肿瘤［1］，尽管近年来针对胶质瘤的传统治疗方法取得了一定程度的进展，但患者的预后仍然不理想［2］。Gemi⁃nin作为一种小分子蛋白，在细胞周期调控中发挥关键作用，可高表达于多种恶性肿瘤，发挥调节肿瘤细胞增殖分化的作用［3］，但其在脑胶质瘤发生、发展中所扮演的角色以及具体的作用机制目前还不清楚。本研究旨在通过基因沉默技术利用siRNA敲除Geminin 在人胶质瘤细胞U251 中的表达，探究其对胶质瘤细胞凋亡、增殖、迁移和侵袭的影响，初步探索可能的发生机制，为明确其是否可以作为胶质瘤治疗的新作用靶点提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2018—2019 年南通大学附属医院20 例患者（男12 例，女8 例；年龄27～74 岁，平均年龄51.5岁，中位年龄48 岁）术后新鲜脑胶质瘤组织和瘤旁正常脑组织的标本，所有参与实验的患者术前均未接受任何放化疗等抗肿瘤治疗，其临床病理资料和随访记录均完整。本实验经南通大学附属医院伦理委员会批准，知情同意书齐全，均由患者或其家属签署。人胶质瘤U251 细胞株购自中国科学院上海细胞研究所。胎牛血清（FBS）购自美国Gibco 公司；LipofectamineTM2000 脂质体转染试剂购自美国Invitrogen 公司；qRT⁃PCR 试剂盒购自美国Promega公司；Cell Counting Kit⁃8（CCK⁃8）试剂盒购自上海BestBio 公司；抗HBO1、Cdt1、GAPDH 抗体及二抗均购自美国Abcam 公司；siRNA 片段购自上海晶赛公司；其余试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 GEPIA数据库及qRT⁃PCR分析Geminin在脑胶质瘤中的表达

为了获得Geminin 在神经胶质瘤中的表达模式，我们利用来自基因表达谱数据动态分析（gene expression profilling interactive analysis，GEPIA）数据库（http：//gepia.cancer⁃pku.cn/）的数据进行分析。另外使用qRT⁃PCR 方法检测20 例人新鲜胶质瘤组织中Geminin 的表达情况，具体方法如下：TRIzol 提取胶质瘤组织中的总RNA，然后按逆转录试剂盒及qRT⁃PCR 试剂盒说明操作，Geminin 特异性引物序列：（上游）5′⁃AGAAAATGAGCTGTCCGCAGG⁃3′；（下游）5′⁃TACAGCGCCTTTCTCCGTTT⁃3′，产物大小213 bp；以GAPDH作为内对照，其特异性引物序列：（上游）5′⁃GAAGGTCGGAGTCAACGGAT⁃3′；（下游）5′⁃TCCCGTTCTCAGCCATGTAGTT⁃3′，产物大小131 bp。PCR 扩增通过以下条件进行，95 ℃5 min，然后95 ℃30 s，60 ℃20 s，72 ℃30 s，40个循环。最终结果用2-ΔΔCt法进行计算。所有实验独立重复3次。

1.2.2 细胞培养和转染

人脑胶质瘤U251 细胞在37 ℃、5%CO2、95%饱和湿度的培养箱中用含有10% FBS、链霉素（100 μg/mL）和青霉素（100 U/mL）的RPMI1640 细胞培养基传代培养。后续的实验研究取处于对数生长期的细胞。Geminin 特异性siRNA 序列为：（上游）5′⁃GGUCCUGAAGCCAAUGAAA⁃3′，（下游）5′⁃UUUCAUUGGUTTUAGGAUU⁃3′；阴性siRNA 序列为：（上游）5′⁃CGGCT⁃TCGCGGGCGACGGA⁃3′，（下游）5′⁃GAGGAGCTGGAAGCAGCCG⁃3′；后续实验共设置有3 组：空白对照组（Control）、阴性对照组（si⁃NC）和干扰组（si⁃Geminin）。当U251细胞生长至融合度达约50%时，利用脂质体转染法（参照说明书），将Geminin 特异性siRNA 序列及阴性序列分别转染至U251细胞，然后用qPCR法检测细胞转染的效率。

1.2.3 CCK⁃8法检测细胞增殖情况

siRNA 转染24 h 后，将细胞消化，然后在96 孔板中以1×104个/孔的密度在CO2培养箱中培养。每隔24 h通过CCK⁃8试剂盒测量细胞活性，每次检测之前，将CCK⁃8 试剂加入板中后在培养箱中培养1.5 h。最后测定450 nm波长下分析光密度，并绘制细胞增殖曲线。所有实验独立重复3次。

1.2.4 Transwell实验检测细胞侵袭和迁移情况

利用Transwell 小室测定U251 细胞的侵袭与迁移能力。将熔融过夜的100 μL Matrigel 添加到24孔板的Transwell 小室上室中，均匀摇晃，并置于37 ℃的CO2培养箱中4～6 h，以形成凝胶。然后将500 μL 无血清培养液加入到下室中，并且将底物膜水合30 min。将转染后48 h的U251 细胞以1×105个/孔的密度转接至涂有基质的Transwell 上室中，将500 μL 全培养液加入下腔室中，过夜后，移开小腔室，并用棉签擦拭上腔室中剩余的细胞。PBS 清洗后，4%多聚甲醛固定30 min；0.1%的结晶紫染色20 min，PBS 清洗，在显微镜下随机选择5 个视野进行观察和计数。迁移实验类似，采用Transwell 腔室代替基质涂层腔室，进行细胞迁移能力测定。所有实验独立重复3次。

1.2.5 蛋白质印迹法检测干扰后Geminin、HBO1、Cdt1的蛋白表达水平

转染48 h后，分别收集3组细胞，按试剂盒说明操作，裂解细胞，提取蛋白质，测定蛋白浓度；然后将总蛋白20 μg 样品加到12%分离凝胶上并转膜；TBST洗涤5 min，室温下5%脱脂奶粉溶液中封闭2 h；TBST洗涤后，4 ℃下孵抗Geminin（1∶200）、抗HBO1（1∶200）和抗Cdt1（1∶200）一抗过夜；TBST 洗涤后，室温下将膜孵HRP 标记的二抗（1∶5 000）2 h。最后ECL显色，LabWorks 灰度图像分析软件分析。所有实验独立重复3次。

1.3 统计学方法

应用SPSS 22.0和Graphpad 5.0软件对数据进行统计学处理。其中计量资料以均数±标准差（）表示，实验数据的两组间比较行t检验，多组均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Geminin在胶质瘤组织的表达情况

从GEPIA 数据库获得的结果表明，无论是低级别胶质瘤还是胶质母细胞瘤组织中Geminin 的表达均明显高于瘤旁正常脑组织（图1A、B，P＜0.05）。同时本课题组利用qRT⁃PCR 实验方法得出的结果显示，20 例新鲜胶质瘤组织中Geminin mRNA 的表达（1.30±0.22）明显高于瘤旁正常脑组织（0.88±0.19），差异具有统计学意义（P＜0.05，图1C）。

图1 胶质瘤组织中Geminin的表达水平增高Figure 1 High expression of Geminin in glioma tissues

2.2 Geminin基因沉默

qRT⁃PCR 检测基因沉默对U251 细胞内Gemi⁃nin 基因表达的影响，结果显示，与Control 组（1.01±0.18）及si⁃NC 组（0.96±0.08）相比，si⁃Geminin 组（0.18±0.05）中Geminin mRNA 表达水平显著降低（P＜0.05，图2）。

2.3 Geminin基因沉默对U251细胞增殖的影响

CCK⁃8 法检测Geminin 基因沉默对U251 细胞的增殖的影响，结果显示，与Control 组及si⁃NC 组相比，si⁃Geminin 组细胞存活率显著降低（P＜0.05，图3）。

2.4 Geminin 基因沉默对U251 细胞迁移和侵袭的影响

Transwell 实验结果显示，si⁃Geminin 组U251 细胞迁移数量［（70.33±5.51）个/视野］和侵袭数量［（29.00±3.61）个/视野］与Control 组［迁移（146.33±13.20）个/视野；侵袭（81.67±5.13）个/视野］及si⁃NC组［迁移（144.00±5.57）个/视野；侵袭（86.67±7.68）个/视野］相比均显著降低（均P＜0.05，图4）。

图2 Geminin 基因沉默对U251 细胞Geminin mRNA 表达水平的影响Figure 2 Effect of Geminin gene silencing on Geminin mRNA expression in U251 cells

2.5 Geminin 基因沉默对U251 细胞内HBO1、Cdt1蛋白表达的影响

图3 Geminin基因沉默对U251 细胞增殖的影响Figure 3 Effect of Geminin gene silencing on U251 cell proliferation

Western blot 实验检测Geminin 基因沉默对U251 细胞内Geminin、HBO1、Cdt1 蛋白表达的影响。结果显示，与Control组及si⁃NC组相比，si⁃Gem⁃inin 组U251 细 胞 内Geminin（0.36±0.03）、HBO1（0.39±0.02）、Cdt1蛋白（0.31±0.04）表达水平均显著降低（P＜0.05，图5）。

3 讨论

图4 Geminin基因沉默对U251细胞迁移和侵袭的影响（×400）Figure 4 Effect of Geminin gene silencing on U251 cell migration and invasion（×400）

图5 Geminin基因沉默对U251 细胞内HBO1、Cdt1蛋白表达的影响Figure 5 Effect of Geminin gene silencing on protein expressions of HBO1，Cdt1 in U251 cells

胶质瘤是起源于神经外胚层最常见的原发性脑肿瘤，占成人恶性脑肿瘤的70%以上［1］，具有高度恶性及高病死率的特点，患者预后不良［4］。目前对该肿瘤患者的治疗临床上仍然采用外科手术治疗与术后放疗化疗相结合的方法，此方法对于胶质瘤的治疗存在一定的缺陷［5］：首先，因胶质瘤肿瘤本身的特点及生长部位的特殊性外科手术不能完全切除；其次，因为血脑屏障的存在，该肿瘤细胞对放疗和化疗不敏感。因此不能完全根治，而且容易复发。有研究表明，脑胶质瘤的发生、发展可能与基因突变引起神经干细胞分化失调存在一定的相关性［6］，鉴于此，用于胶质瘤早期发现与治疗的一系列生物标志物正在深入研究中［7］。目前虽然用于胶质瘤治疗的靶点［8⁃9］（如血管生成拟态、肾母细胞瘤Ⅰ基因产物、miR⁃128）及新兴的靶向性药物［10］、抗PD⁃1/PD⁃L1［11］及CAR⁃T 治疗［12］等已初见成效，但并未获得突破性进展。因此寻找新的、行之有效的分子靶点势在必行。

Geminin 由McGarry 和Kirschner［13］首次发现，是一种小分子多功能的核蛋白，主要在细胞增殖中发挥作用［14］。Geminin 在许多不同类型的肿瘤中高表达，如消化系统肿瘤（胃癌、肠癌等）、口腔恶性黑色素瘤、乳腺癌及肺癌等［15］，其高表达常预示肿瘤细胞侵袭性高，提示肿瘤患者不良预后［16-17］。除了在保持基因组保真度方面发挥作用外，Geminin 对于胚胎发育的多个方面也是必需的，并且可以通过与染色质调节复合物的相互作用来控制胚胎基因的表达［18-19］，可促进胚胎干细胞向神经组织的生成［20］。研究发现，Geminin作为DNA复制的拮抗剂和调节剂，可以调整神经干细胞和室管膜细胞的比例进而可能对胶质瘤的发生及发展产生影响［21］。因此，本课题组通过基因沉默技术研究其在胶质瘤组织的表达模式以及对人胶质瘤细胞生物学行为产生的影响和可能发生的分子机制。结果显示，Geminin 在胶质瘤中表达增高，转染siRNA后胶质瘤U251细胞中Geminin mRNA 及蛋白表达水平显著下降，细胞的增殖能力降低，细胞的迁移和侵袭的数量减少，由此可以推断，Geminin 的高表达与胶质瘤的发生、发展及恶性程度密切相关。

Cdt1是重要的细胞周期调控因子，且与肿瘤的发生发展有着密切的关系［22］。在细胞周期中，Cdt1对于将DNA 解旋酶加载到DNA 复制起点上至关重要，并受Geminin的调节，有研究发现，Geminin通过控制细胞周期内DNA 复制的重新启动来维持基因组保真度［14］，Geminin 可双重调控Cdt1，在细胞周期中特异性结合Cdt1 构成了控制Cdt1 活性的第3 个系统，既可以防止Cdt1 重新启动DNA 复制（S/G2 阶段，负向调控），又可以保护Cdt1免受蛋白水解降解（G2/M 阶段，正向调控）［23-24］。而HBO1 可直接与Cdt1相互作用，作为Cdt1的募集辅助因子直接参与了RC前的形成，增强Cdt1依赖的DNA复制，促进细胞的增殖。HBO1 最初被鉴定为起源识别复合物（ORC）的伴侣，其中包含1 个保守的MYST 域，该域可乙酰化组蛋白并调节染色体结构，在细胞周期中，HBO1通过两种方式调节DNA复制，其一是乙酰化H4K5/8/12，促进复制前复合物（Pre⁃RC）的形成；其二是乙酰化H3K14，促进CDC45的加载，激活S期DNA 的复制［25］。有研究显示，HBO1、MOZ 和ORF HAT 复合物的靶向亚基ING5 的异位表达可增加Oct4、Olig2 和Nestin 等神经干细胞标志物的表达，促进肿瘤的自我更新，防止谱系分化［26］。近期研究结果显示，HBO1在膀胱癌中的高表达可通过增强β⁃catenin在膀胱癌细胞中的核易位以及上调β⁃catenin下游靶基因如c⁃myc、c⁃Jun、CCND1、CTLA4、LEF1、TCF1 和Axin2 等的表达，影响膀胱癌细胞的增殖、侵袭和转移［27］。而Geminin在细胞周期中对HBO1、Cdt1 不平衡的调节作用可能导致DNA 复制缺陷和基因组的不稳定，从而影响细胞的正常增殖、侵袭和转移能力，最终导致肿瘤的发生［28］。但在胶质瘤细胞中，Geminin对HBO1、Cdt1的作用尚未有研究。

本实验通过基因沉默技术敲除Geminin后检测U251 细胞中HBO1、Cdt1 的表达情况，结果显示，Geminin 沉默后Geminin、HBO1 及Cdt1 蛋白的表达水平均降低，由此我们推测在胶质瘤细胞中，Gemi⁃nin的高表达可能影响HBO1、Cdt1的表达及相互作用，促进DNA复制，进而增强胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。有研究报道，Geminin 蛋白可通过影响Wnt信号通路和上皮型钙黏蛋白的表达对上皮细胞间质化进行影响［29］。在脑胶质瘤中，Geminin对HBO1、Cdt1二者的影响是否与此通路相关，其中是否还有其他的作用机制尚不清楚，有待于今后进一步的研究和探索。