苦参碱调控Wnt/β⁃catenin途径抑制宫颈癌细胞系Caski细胞侵袭迁移

郑荣芳，刘 伟，张芸中，樊学芬，郭钰珍*

1兰州大学第二医院妇科，2麻醉科，甘肃 兰州 730000

宫颈癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，起源于宫颈腺柱状上皮、鳞状上皮以及储备细胞，其恶性程度较高，呈浸润生长且易发生转移［1］。已有大量研究表明肿瘤发生侵袭迁移与Wnt/β⁃catenin通路具有重要关系，该通路异常直接影响肿瘤的转移［2］。Wnt/β⁃catenin信号通路变化能够促进宫颈癌的发生发展［3］，β⁃catenin 作为转导途径的核心元件参与调节该通路［4］，从而促进宫颈癌的发生发展［5］。Wnt2B可以通过经典Wnt 途径调节肿瘤的发生发展，Wnt/β⁃catenin 通路激活后，胞浆中的β⁃catenin 表达上调［6］，GSK⁃3β作为β⁃catenin 上游重要的负性调控因子，其失活与β⁃catenin 的表达呈正相关［7］。

苦参碱（matrine）是一个四环的喹嗪啶类生物碱，广泛存在于豆科植物苦参、山豆根和苦豆子中［8］。苦参碱具有广泛的药理作用，如抗炎、抗肝纤维化、镇痛和抗心律失常等，苦参碱制剂不良反应较少，应用广泛［9］。已有研究表明其具有良好的抗肿瘤特性，参与调节肿瘤增殖、凋亡、血管生成、侵袭迁移等相关的多条信号通路［10-14］。且有研究表明，苦参碱在人白血病细胞、乳腺癌以及人鼻咽癌细胞中，均可通过抑制Wnt/β⁃catenin 信号通路的激活降低癌细胞生长活性和诱导其分化［15］。故本研究将基于Wnt/β⁃catenin 信号通路研究苦参碱抑制宫颈癌细胞系Caski细胞侵袭迁移的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料

人宫颈癌细胞系Caski 细胞购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。苦参碱（上海源叶公司）；MTT、二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、DMEM 高糖培养基（北京索莱宝生物科技有限公司）；Transwell 小室（Millipore 公司，美国）；基质胶（Matrigel，BD 公司，美国）；胎牛血清（fetal calf se⁃rum，FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司）；MMP⁃9 ELISA 试剂盒、VEGF ELISA 试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；RIPA 裂解液、SDS⁃PAGE 凝胶试剂盒、山羊抗兔二抗（上海碧云天生物技术有限公司）；TRIzol、逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；兔抗β⁃catenin 单克隆抗体、兔抗p⁃β⁃catenin 单克隆抗体（Abcam 公司，英国）。引物序列：GSK⁃3β上游5′⁃CACCTCTGGC⁃TACCATCCTTAT⁃3′，下游5′⁃ATTATTGGTCTGTC⁃CACGGTCT⁃3′；Wnt2B 上游5′⁃GTGTCCTGGCTG⁃GTTCCTTA⁃3′，下游5′⁃AGCTGGTGCAAAGGAA⁃AGAA⁃3′；GAPDH 上游5′⁃AAGGCTGTGGGCAAGG⁃3′，下游5′⁃TGGAGGAGTGGGTGTCG⁃3′。

1.2 方法

1.2.1 MTT细胞增殖实验

取对数生长期细胞消化成单细胞悬液，计数后配制成1.5×105个/mL，以每孔100 μL 加入96 孔板中，37 ℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱培养24 h后，分别以0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 g/L 终浓度加入苦参碱，每组设6 个平行孔，加入相同体积的溶媒作为空白对照，分别处理24、48、72 h后，每孔加入20 mL MTT溶液（5 mg/mL），继续培养4 h后，弃去上清，每孔加入150 μL DMSO 溶解MTT，于490 nm 处检测光密度（optical density，OD）值，计算抑制率，抑制率=［（OD空白组-OD实验组）/OD空白组］×100%。

1.2.2 细胞侵袭实验

将Transwell 小室放入24 孔板，4 ℃预冷后，上室加入1∶4 稀释的Matrigel，待凝固后，上室加入无血清培养基配制的细胞悬液400 μL，下室加入20%FBS 的培养基，待细胞沉降后上室分别加入0.4、0.8 g/L 终浓度苦参碱，每组设6 个平行孔，加入相同体积的溶媒作为空白对照，处理24 h后，取出小室，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗后-20 ℃预冷甲醇固定5 min，用棉签轻轻拭去上室未迁移的细胞，结晶紫染色5 min，PBS 漂洗，拍照，计数。

1.2.3 细胞迁移实验

将Transwell小室放入24孔板孔，上室加入无血清培养基配制的细胞悬液400 μL，下室加入20%FBS的培养基，待细胞沉降后上室分别加入0.4、0.8 g/L终浓度苦参碱，每组设6个平行孔，加入相同体积的溶媒作为空白对照，处理24 h 后，取出小室，PBS 漂洗后-20 ℃预冷甲醇固定5 min，用棉签轻轻拭去上室未迁移的细胞，结晶紫染色5 min，PBS漂洗，于倒置显微镜观察拍照，统计细胞迁移率。

1.2.4 ELISA实验

取对数生长期细胞，加入0.4、0.8 g/L 终浓度苦参碱，加入相同体积的溶媒作为空白对照，处理24 h后，收集无血清培养基，参照ELISA试剂盒说明书检测培养基中MMP⁃9、VEGF含量。

1.2.5 qRT⁃PCR实验

取对数生长期细胞，加入0.4、0.8 g/L 终浓度苦参碱，加入相同体积的溶媒作为空白对照，处理24 h后，加入1.5 mL TRIzol 于冰上吹打细胞，室温静置5 min，13 000 r/min离心5 min，吸取上清，加入氯仿，静置离心，吸取上清加入异丙醇，静置离心，弃去上清，75%乙醇清洗沉淀，离心弃上清，保留沉淀干燥，用DEPC 水溶解。然后按照TaKaRa 反应试剂盒依次经过去除基因组DNA 反应、反转录反应和qPCR进行扩增，扩增程序为：95 ℃10 min 预变性；95 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃30 s 40个循环。2-ΔΔCt计算基因的表达量，其中ΔΔCt=（待测样品目的基因的Ct 平均值-待测样本看家基因的Ct 平均值）-（对照样品目的基因的Ct 平均值-对照样本看家基因的Ct 平均值）。

1.2.6 Western blot实验

取对数生长期细胞，加入0.4、0.8 g/L 终浓度苦参碱，加入相同体积的溶媒作为空白对照，处理24 h后，加入RIPA裂解液，置于冰上研碎至匀浆后，4 ℃放置30 min，13 000 r/min 离心10 min，取一部分上清，BCA 试剂盒检测蛋白浓度，另取部分上清加入4×上样缓冲液，煮沸变性后，加到4%浓缩胶浓缩，10%分离胶分离，再经过转膜、封闭，4 ℃孵育一抗（其中β⁃catenin抗体以1∶2 500稀释，p⁃β⁃catenin抗体以1∶1 000稀释），室温孵育二抗，ECL发光液显色，X医用胶片显影、定影等步骤，最后进行拍照分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS21.0统计软件进行统计分析，所有数据均以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD⁃t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 苦参碱对Caski细胞增殖的影响

随着苦参碱浓度的不断升高，Caski细胞增殖抑制率呈逐渐增大的趋势。在苦参碱浓度＞0.1 g/L时，相同浓度下，对Caski 细胞的抑制率随作用时间的延长而逐步增大（图1），显示苦参碱对Caski增殖抑制作用具有时间、浓度的依赖性。

图1 苦参碱对Caski细胞的增殖抑制作用（n=6）Figure 1 Inhibitory effect of matrine on proliferation of Caski cells（n=6）

2.2 苦参碱对Caski细胞侵袭的影响

随着苦参碱处理浓度的逐步升高，Caski细胞侵袭的数量逐渐减少，且与空白组相比，0.4、0.8 g/L处理组差异均具有统计学意义（P＜0.01，图2）。

2.3 苦参碱对Caski细胞迁移的影响

随着苦参碱处理浓度的升高，Caski细胞迁移的数量逐步减少，且与空白组相比，0.4、0.8 g/L处理组差异均具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01，图3）。

2.4 苦参碱对Caski细胞MMP⁃9、VEGF含量的影响

随着苦参碱处理浓度的升高，Caski细胞上清培养液中MMP⁃9、VEGF含量均逐步降低，与空白组相比，0.4、0.8 g/L 处理组差异均具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01，表1）。

2.5 苦参碱对Caski 细胞GSK⁃3β、Wnt2B mRNA 表达的影响

随着苦参碱处理浓度的逐步升高，Caski细胞内GSK⁃3β mRNA表达量逐渐增加，Wnt2B mRNA表达量逐渐减少，与空白组相比，0.4、0.8 g/L处理组差异均具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01，图4）。

图2 不同浓度的苦参碱对各组细胞Caski侵袭能力变化的影响（结晶紫染色，×200）Figure 2 Effects of different concentrations of matrine on Caski invasiveability in each group（crystal violet staining，×200）

图3 苦参碱对各组细胞迁移能力变化的影响（结晶紫染色，×200）Figure 3 Effects of matrine on the changes of cell migration in each group（crystal violet staining，×200）

表1 各组细胞上清培养液中MMP⁃9、VEGF含量变化Table 1 Changes of MMP⁃9 and VEGF in supernatant medium of each group （）

表1 各组细胞上清培养液中MMP⁃9、VEGF含量变化Table 1 Changes of MMP⁃9 and VEGF in supernatant medium of each group （）

与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，n=3。

2.6 苦参碱对Caski细胞β⁃catenin蛋白及其磷酸化的影响

随着苦参碱处理浓度的逐步升高，Caski细胞内β⁃catenin 蛋白含量逐渐减少，p⁃β⁃catenin（phospho S37）蛋白含量逐渐增多，且与空白组相比，0.4、0.8 g/L处理组差异均具有统计学意义（P＜0.01，图5）。

3 讨论

图4 各组细胞GSK⁃3β、Wnt2B mRNA表达量变化Figure 4 Changes of mRNA expression levels of GSK⁃3β and Wnt2B in each group

图5 各组细胞β⁃catenin、p⁃β⁃catenin蛋白变化Figure 5 Changes of β⁃catenin and p⁃β⁃catenin in each group

大量研究表明苦参碱具有显著的抗癌作用，其可抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、阻止血管生成、侵袭、迁移，且其不良反应小［16］，目前，苦参碱在肝癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤中的作用已有大量研究，表现出良好的抗癌作用［17-19］。但苦参碱对宫颈癌抗癌作用的研究报道较少，本研究选取人宫颈癌细胞系Caski 细胞为对象进行研究，发现随着浓度的升高，苦参碱对Caski 细胞的增殖抑制作用显著升高，与空白对照组相比，差异具有统计学意义，在相同浓度下随着时间的增加，苦参碱对Caski细胞的增殖抑制作用显著升高，提示苦参碱对Caski细胞的增殖抑制作用也具有剂量、时间依赖性。

肿瘤发生侵袭迁移是恶化的标志，抑制肿瘤的侵袭迁移可以有效降低病死率［20］。本研究发现苦参碱可有效抑制Caski 细胞的侵袭迁移，并表现出一定的剂量依赖性。近年来研究发现，Wnt/β⁃catenin 通路与多种肿瘤的侵袭迁移相关，该通路可影响肿瘤胞外基质的降解、血管生成以及细胞迁移黏附，本研究发现苦参碱可以抑制Caski 细胞分泌MMP⁃9、VEGF，MMP⁃9 具有降解胞外基质，促进细胞侵袭的作用。VEGF 通过诱导血管内皮细胞增殖、迁移促进肿瘤血管生成，为肿瘤细胞的迁移提供通道［21-22］，大量研究表明基质金属蛋白酶家族（matrix metalloproteinase，MMP）作为肿瘤侵袭转移的促进因子与Wnt/β⁃catenin 信号通路密切相关［23-24］。MMP 作为Wnt 信号通路下游的直接靶点，β⁃catenin与膜型基质金属酶⁃1（membrane type 1 matrix metal⁃loproteinases，MT1⁃MMP）的共同作用可促进细胞的迁移、侵袭和转移［25］，Zhang 等［26］发现VEGF 启动子上游具有Wnt 信号通路调节序列，Wnt 信号通路可明显上调VEGF 的表达，故本研究推测苦参碱抑制Caski 细胞侵袭迁移通过抑制经典的Wnt/β⁃catenin信号通路实现。Wnt2B 是Wnt 信号通路的胞外信号，与Wnt受体结合后可激活该通路，本研究发现苦参碱可抑制Caski 细胞Wnt2B mRNA 的表达，因此，苦参碱可能首先通过抑制Wnt2B 分泌使Caski 细胞Wnt信号通路整体处于低活性状态。研究显示Wnt信号通路的调节关键在于β⁃catenin 的稳定，当β⁃catenin 水平低下时，Wnt 通路关闭，反之，Wnt 通路开启［27］；而维持β⁃catenin 稳定的关键蛋白是GSK⁃3β，在没有Wnt 信号刺激的情况下，胞质内的GSK⁃3β能与其他蛋白例如结肠腺瘤性息肉病（adenoma⁃tous polyposis coli，APC）蛋白、轴蛋白（axin）等以复合物的形式磷酸化β⁃catenin氨基末端Ser/Thr位点，使β⁃catenin 泛素化降解，维持细胞内β⁃catenin 的低水平状态。β⁃catenin 处于低水平状态，Wnt 通路关闭。在有Wnt 信号刺激的情况下，由细胞分泌的Wnt2B 蛋白与细胞表面受体卷曲同源物（frizzled，FZD）和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（low density lipoprotein receptor related protein，LRP5/6）结合后，即触发细胞内的信号转导：细胞内蛋白散乱蛋白（dishevelled，Dsh）被活化，继而活化的Dsh 与Axin及Frat1 相结合，后两者与GSK⁃3β和APC 形成复合物，T 细胞淋巴瘤的原癌 基 因1（frequently rear⁃ranged in advanced T cell lymphomas⁃1，FRAT1）介导GSK⁃3β从Axin上脱离，不能磷酸化β⁃catenin。本研究发现苦参碱可诱导Caski 细胞内GSK⁃3β mRNA的表达，与空白对照组相比，随着苦参碱浓度的升高，药物处理组GSK⁃3β mRNA 表达越来越多。随着Caski 细胞内GSK⁃3β表达量的增多，其与更多的β⁃catenin结合，打破胞内β⁃catenin磷酸化平衡反应，使更多β⁃catenin 磷酸化降解，正如本研究所显示随着苦参碱处理浓度的增高，Caski细胞内β⁃catenin含量减少，p⁃β⁃catenin 含量增多。大量β⁃catenin 被苦参碱诱导降解，导致β⁃catenin 在细胞内积累受阻，抑制β⁃catenin 转移到细胞核与转录因子TCF 相结合，在其他因子的辅助下协同激活靶基因如VEGF、MMP等侵袭迁移相关因子的表达。

综上，苦参碱可通过抑制Caski 细胞Wnt/β⁃catenin 通路中Wnt2B mRNA 表达以及β⁃catenin 蛋白含量，降低Caski细胞MMP⁃9、VEGF的分泌，进而抑制Caski细胞的侵袭迁移。