贵州核桃农家品种种质资源遗传多样性的SRAP分析

杨小红，侯 娜

(1.贵州省林业科学研究院，贵阳 550005；2.贵州省核桃研究所，贵阳 550005)

核桃为胡桃科(Juglandaceae)胡桃属(Juglans)木本油料植物，其经济及营养价值很高。贵州核桃主要集中分布于毕节市、威宁县、六盘水市、黔西南州等地，除海拔较低的干热河谷地区外，其余各地均有分布。由于贵州省地理气候多样，在长期的自然杂交和实生繁殖及不同立地条件影响下，形成种类繁多的生态型和农家品种[1-2]。

SRAP(Sequence-related amplified polymorphism)，即相关序列扩增多态性，是一种基于PCR的标记系统[3-4,11]，已应用于西藏光核桃和新疆野核桃的遗传多样性分析、遗传连锁图谱的构建、核心种质构建，以及核桃雌花开花期相关分析[5-9]，但尚未见SRAP标记应用于贵州核桃农家品种的报道。本研究对贵州核桃农家品种进行了遗传多样性的SRAP分析，以期为资源的收集、分类和鉴定及育种工作提供基础数据。

1 材料与方法

试验材料采自贵州省六盘水市、普安县、贵阳市、兴义市、赫章县、毕节市、沿河县生长良好、无病虫害的样株，随机取样，以幼嫩叶片作为试验材料，共收集了168份核桃叶片样品。

1.1 主要试剂、引物及仪器

SRAP引物选择参考Li等[3]的方法，由苏州泓迅生物科技有限公司合成；CWBIO北京生物技术有限公司提供dNTP Mixture、10×PCR Buffer、25 mmol·L-1MgCl2、TapDNA聚合酶；天根生化科技服务有限公司提供100 bp DNA marker[10-12]。

供试仪器为Long Gene A 200型PCR仪(朗基公司)、DYY-12型电泳仪(北京六一公司)等。

1.2 DNA提取

采集新鲜嫩叶，装入放有硅胶的封口袋中，做好标记，待干燥好后放到-20 ℃冰箱中保存待用[10-11]。基因组DNA的提取参照任耀忠的方法；测定DNA的浓度和纯度(用核酸蛋白分析仪)后，加入超纯水使DNA样品浓度稀释到10 ng·μL-1，保存在-20 ℃冰箱备用[10-11]。

1.3 筛选SRAP-PCR引物组合

该反应在Long Gene A 200型PCR仪上进行。PCR反应体系为：CWBIO北京生物技术有限公司提供的10 μL 2×TaqMasterMix，总体积20 μL，100 μmol·L-1正反向引物各1.0 μL，7 μL的双蒸水和1 μL的模板DNA。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；前5个循环为94 ℃变性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min；随后进行的35个循环为94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min；最后72 ℃延伸10 min，保存于4 ℃[13-15]。

扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶(凝胶浓度为8%，电泳缓冲液为0.5×TBE)电泳检测，室温电泳2 h，稳压250 V，显色方法为银染法[13,15]。用4份样品编号为10、33、50、160(分别采自盘州市、普安县、贵阳市花溪区、修文县)的DNA作为模板对132对SRAP引物组合筛选多态性引物，后续的试验选用多态性好的引物[13]。

1.4 处理数据

使用清晰可辨且重复的SRAP扩增条带，建立数据矩阵，无谱带计为0，有谱带计为1。计算多态性引物的多态性条带与总扩增条带比率。用NTSYS-pc2.10 e软件进行个体聚类分析，构建聚类图；使用Popgen 32软件计算群体的Nei’s基因多样性指数(H)、多态性位点百分率(PPB)、观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Shannon’s信息指数(I)[13]。

2 结果与分析

2.1 筛选与扩增SRAP-PCR引物

通过筛选SRAP引物，有19对引物组合能够扩增出可重复且清晰的条带(表1)，条带多数集中在50～1 000 bp间，且条带清晰，故截选50～1 000 bp间的条带进行分析比较[11,13]。

表1 所用SRAP引物序列Table 1 SRAP primer sequences

利用Quantity One软件进行条带统计，分析过程中，去除lane背景时统一将rolling disk size设置为5，detect band时，统一将Noise Filter设置为10。Report Options选择Mol.Wt、Average Trace、Peak Density。将结果转入Excel并转化为0,1矩阵。

19对引物组合共扩增出309条条带，其中多态性条带281条，占总条带的90.94%，表明样本种质具有丰富的DNA序列多态性。

2.2 基于SRAP结果的遗传多样性分析

2.2.1Shannon’s多样性指数和Nei’s基因多样度分析

应用POPgene 32软件计算实验样本的有效等位基因数位点数(Ne)，Nei’S基因多样性(H)，Shannon’S信息指数(I)等参数估算计算整体和居群内的遗传多样性指数(表2)。

表2 SRAP标记估算遗传多样性参数Table 2 Genetic diversity parameters estimation estimated by SRAP markers

分析表2可以发现，各种源的多态位点百分率为20.71%～92.56%；6个种源中，以兴义种源的遗传多样性最丰富(PPB=92.56%，Na=1.925 6，Ne=1.344 2，H=0.219 7，I=0.349 6)，其次是贵阳市、盘州市、普安县、威宁县、沿河县。平均水平的遗传等位基因数(Na)是2.000 0，有效等位基因数(Ne)为1.358 8，Shannon’s信息指数(I)为0.356 4，Nei’s基因多样度(H)为0.225 6。

2.2.2亲缘关系聚类分析

所采集的样品包括串核桃、乌仁泡核桃、细香泡核桃、珍珠泡核桃、光滑(泡)核桃、麻壳泡核桃、铁夹泡核桃、夹绵泡核桃等农家品种[16]，应用NTsys 2.10 e软件得聚类分析树状图(图1)，由图1可以看出，相似系数0.62处，所有核桃样品聚类2个类群[13]；相似系数0.72处，所有样品聚类10个类群。表明这些农家品种具有亲缘关系。

3 讨论与结论

一个居群生存、发展和进化的基础是遗传多样性，它包括生物所携带遗传信息的总和[13,17]。遗传多样性分析显示，兴义市的遗传多样性最丰富。产生遗传多样性变化的原因复杂多样，受遗传漂变、自然选择、生殖方式、基因流等因素影响，其本质原因是物种等位基因数目或频率的变化，还包括地理隔离、环境变化及人为干扰等[13]。来自兴义市的样本覆盖范围较广，试验所采样本数量最大，种质遗传基础宽于其他各区，自然遗传多样性水平偏高[13]。另外，由于各种源地种质的重合度高，遗传相似性水平较高。由于贵州核桃农家品种众多，所采集的样本有限，未能充分代表其多样性和复杂性，因此还需要进一步收集样本，全面评估贵州核桃农家品种的遗传多样性，为贵州核桃农家品种种质资源的开发和利用奠定基础。