藜麦种子EMS诱变条件初探

王育川,董艳辉,2,温 鑫,李亚莉,侯丽媛,刘 江,赵 菁,曹秋芬,黄春国,吴慎杰,秦永军,2

(1.山西农业大学生命科学学院，太原 030031；2.农业部黄土高原作物基因资源与种质创新重点实验室，山西 太原 030031；3.山西农业大学山西有机旱作农业研究院，太原 030031；4.山西农业大学，山西 太谷 030801)

藜麦(ChenopodiumquinoaWild)，藜科一年生草本植物，是原产南美洲安第斯山脉地区的一种天然伪谷物。作为当地一种重要的粮食作物，已经有超过7 000年的种植历史[1]。藜麦对于盐碱、干旱、高海拔等较极端生境具有广泛适应性[2-3]，籽粒富含维生素、天然抗氧化剂和配比均衡的必需氨基酸等各类营养物质，且为基本营养物质的非过敏源，可供食物不耐受(例如麸质不耐受)人群食用[4]，被联合国粮食及农业组织(FAO)认定为21世纪人类营养最有前途的作物之一[5-6]，也是可能缓解全球粮食危机的一种谷物[7]。近年来，藜麦在世界各地广泛引种种植[8]，但藜麦品质与产量仍受品种自身特性、环境因素等制约，因此选育优良品种对于藜麦发展十分必要。采用传统的杂交及轮回选择等方式，育种周期较长，人力、土地等资源消耗过大且不易选择到目标性状。借助诱变及分子育种等新型方式操作相对简单、特异性较强，容易获得稳定遗传的突变体，这对于扩充藜麦种质资源库、获得优良品种意义重大。

烷化剂EMS(甲基磺酸乙酯)作为一种最常用的化学诱变剂，成本较低、诱变效率较高，且较容易获得传统育种方式难以得到的性状[9-10]，被广泛应用于植物和真菌中[11-12]。EMS诱变已成功应用于小麦[13-14]、水稻[15]、玉米[16]、棉花[17]、番茄[18]、苦瓜[19]等作物中。藜科植物甜菜中也有研究[20]，并已经获得生物学性状得到改变的株系[21-22]。藜麦中通过EMS诱变Regalona Baer品种得到对咪唑啉酮类除草剂高耐受性的株系[23]；也有研究筛选到下胚轴颜色异常的突变体[24]，这为藜麦种子进行EMS诱变提供了可能。

本实验以自育白种藜麦干种子为试验材料，参考甜菜等作物种子的EMS诱变适宜浓度和处理时间，设置一系列浓度和时间梯度条件进行诱变处理。通过连续统计种子发芽势和发芽率并进行相关统计学的分析，最终确定EMS诱变藜麦种子的最佳条件，旨在创制藜麦新种质，为后续诱变并构建藜麦突变体库奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试种子为山西静乐白种藜麦(暂定静乐白-02)，由山西农业大学生命科学学院(原山西省农业科学院生物技术研究中心)自行选育。藜麦植株种植于山西省静乐县娑婆乡长棱角村。种子于上一年9月下旬至10月上旬收获，经晾晒干燥、脱粒并去除杂质后保存备用。

试验用EMS原液原产Sigma公司，其它试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 实验方法

本实验分别用5个EMS浓度(V/V)0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，4个时间梯度(8 h、10 h、12 h、14 h)进行诱变处理。每个处理时间均设置2个对照组，分别为蒸馏水对照组(ck1)和磷酸缓冲液对照组(ck2)。实验共设置28个处理，每处理3次重复。

1.2.1溶液配制

0.1 mol·L-1磷酸缓冲液：分别配制0.2 mol·L-1的Na2HPO4、NaH2PO4作为母液，工作液按照Na2HPO4∶ NaH2PO4=67∶33体积比混合后稀释而成。

不同浓度EMS-磷酸缓冲液分别由EMS原液与0.1 mol·L-1磷酸缓冲液按照体积比混合配制而成。

0.1 mol·L-1Na2S2O3溶液配制：称取26 g Na2S2O3·5 H2O 固体溶解于加热煮沸后冷却的蒸馏水中，再加入0.2 g Na2CO3粉末，完全溶解后定容至1 L，盛装于预先灭菌的棕色瓶中密封、避光保存。

1.2.2实验流程

诱变详细流程如下：

选种：挑选饱满、无损且未发芽的藜麦种子，每100粒一组分装于5 mL离心管中备用。

浸种：预先用蒸馏水清洗种子2次，然后室温(19～21 ℃)蒸馏水浸种2 h。

诱变处理：向控干水分的各管中分别加入3 mL对应浓度的EMS-磷酸缓冲液(ck1加等量蒸馏水，ck2加等量磷酸缓冲液)，黑色塑料袋包裹后置于水平摇床(100 r·min-1)，室温黑暗处理相应时间。

诱变终止：弃废液，向管内加入3 mL Na2S2O3溶液静置10 min以终止反应。

漂洗：弃终止剂，加满蒸馏水轻轻颠倒冲洗，至少冲洗4次，每次10 min。

点种：种子沥干后，分组置于垫有湿滤纸的培养皿中4 ℃冷藏过夜，次日，点种于预先搅拌好的基质中进行发芽实验。

注意事项：为防止EMS对环境造成不良影响，废液以及沾染过EMS的器皿收集后加0.1 M Na2S2O3溶液中和过夜，再用大量清水冲洗。

1.3 数据统计与分析

以藜麦种子下胚轴破土作为萌发的种子进行计数，以点种当天作为第0天，从第1天开始每天14：00—18：00观察并记录发芽情况。相关统计指标如下：

相对致死率(%)=(1-相对发芽率)×100%。

原始数据记录在Microsoft Excel软件上进行，利用SPSS 19.0软件进行方差分析，Origin 8软件作图，使用DPS 7.05软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对藜麦种子萌发动态的影响

尽管各组种子在点种时芽已经开始伸长，但点种当天均没有萌出基质。点种后第1天开始，陆续开始破土萌发。最早出苗的是ck1、ck2和0.5%浓度处理组。其中，ck1和ck2在8 h及14 h下，第1天起始萌出，其余两个处理时间在第2天起始萌出，0.5%浓度的处理组则相反；从1%处理组开始，起始萌发时间推迟，具体表现在除1%、8 h在第2天而2%、14 h，2.5%、14 h等浓度高、时间长的组合始终未萌发外，其余组合均在第3天以后开始萌发，且随着浓度升高、作用时间延长，推迟萌发时间越久，到第8天，萌发起始完全；直至第14天，各处理组出苗数基本稳定。

观察发现，对照组、0.5%组及1%、8 h组萌发高峰期集中在第2天，其余组合均在第3天后，且萌发高峰期表现出与起始萌发时间一致的趋势。统计表明，对照组萌发起始到发芽数稳定只需要1～2 d，EMS浓度组种子萌发较不整齐，集中萌发时间可延长至4～6 d。汇总各组合累计发芽数为图1，在整个统计周期内，EMS处理组发芽总数也较对照减少。方差分析结果显示，除0.5%浓度组外，EMS浓度对种子初始萌发时间和萌发高峰期均产生极显著影响(p<0.01)，然而不同处理时间影响并不显著(p>0.05)。

2.2 不同处理对藜麦种子发芽势和发芽率的影响

由于各处理组种子萌发高峰期不尽相同，最后出苗组合在第9天左右达到萌发高峰，故以第9天种子累计发芽数计算发芽势。经统计，对照组ck1和ck2发芽势最高，平均值分别为89.7%、89.6%，且二者之间差异不显著；EMS处理组中除0.5%浓度组合及1%、8 h组合外，发芽势都较对照组显著降低(图2-A)，且在同一处理时间下，随着浓度的升高，发芽势呈降低趋势，2%、12 h与2.5%的8 h、10 h处理相对发芽势分别为1.1%、3.7%、1.5%，2%、14 h以及12 h、14 h处理相对发芽势为0(图2-C)，这说明当EMS浓度提高到一定程度时，EMS对藜麦种子发芽势有显著的抑制作用。对比相同EMS浓度条件下不同处理时间的种子发芽势，可以看出，除0.5%、14 h，1.5%、10 h两个组合外，其他组合随着时间延长，发芽势呈下降趋势(图2-A)。这两个组合的例外可能预示着EMS浓度及处理时间两个因素间存在互作。

选取出苗数目基本稳定的第14天作为统计发芽率的时间。据图2-B、2-D可知，种子发芽率与发芽势表现趋势基本一致。同样发现，高浓度EMS对藜麦种子发芽率抑制作用显著。而在0.5%、8 h，0.5%、10 h及1%、8 h等低浓度短时间的组合中，发芽势和发芽率与对照差异不显著，表明藜麦种子对EMS低浓度可能不敏感。对比0.5%及1.5%浓度组的发芽势情况，发现其发芽率也分别呈现8 h>10 h>14 h>12 h和10 h>8 h>12 h>14 h的趋势，即同一EMS浓度下，随着时间的延长，发芽势与发芽率的降低趋势并不是线性的。这再次说明，藜麦种子EMS诱变实验中，浓度与处理时间之间可能存在互作关系。

为了评价实验中EMS浓度与诱变处理时间对藜麦种子发芽势和发芽率的效用，进行了双因素方差分析。据表1所示，EMS诱变剂浓度和处理时间对藜麦种子发芽势、发芽率、相对发芽势以及相对发芽率均影响极显著，且二者间的互作也达到了极显著的水平(p<0.01)。表明种子发芽率的降低是诱变浓度与时间共同作用的结果。因此，选择诱变藜麦种子的适宜条件时，应综合考虑这两个因素。诱变实验中，公认发芽率降低到50%的半致死率是衡量不同诱变处理效果的重要参数。通常认为半致死剂量为适宜诱变条件。本实验中，预先浸种2 h，1.5%、12 h的组合平均相对发芽率为51.3%，其相对致死率48.7%接近半致死率。此外，2%浓度处理8 h和10 h致死率较接近半致死剂量(相对致死率分别为45%、55%)。

表1 藜麦种子发芽势和发芽率的方差分析Table 1 Variance analysis of seed germination potential and germination rate of C.quinoa

3 结论与讨论

目前，已经有多种育种方式应用到藜麦种质资源创新及改良中，然而诱变相关的报道还很少。2013年秘鲁首次利用γ射线辐射诱变藜麦干种子，得到株高、生育期、株型叶形等形态学指标发生改变甚至种子颜色变化的植株[25]。随后的研究中，他们成功得到了具有稳定的矮化、高产、生育期缩短、高蛋白、皂苷含量降低等表型的品系[26]。化学诱变中，经叠氮化钠(NaN3)处理获得了高皂苷、高蛋白的突变体[27]。与其他诱变方式相比，EMS作为一种被成熟应用的化学诱变剂，诱变后突变频率较高，且多为显性点突变，有利于突变体的获得和筛选。而其在藜麦仅有的报道中，并没有最适诱变条件探究。本实验首次系统探究了藜麦种子诱变的适宜条件。通过设置不同EMS浓度及处理时间，综合考虑二者的影响，以半致死条件LD50为适宜条件原则，确定预先浸泡2 h后，1.5%浓度处理12 h为适宜条件。另外，2%浓度条件下分别处理8 h及10 h相对致死率也较接近半致死剂量，处理时可酌情进行选择。与谷子[28]、糜子[29]等小颗粒种子作物相比，藜麦种子对诱变剂EMS响应的初始浓度更高。这可能与藜麦抗逆性较强的特性有关。相应的处理时间也较长，这一点在与藜麦亲缘关系较近的甜菜[22]中也有体现。

适宜条件在预实验中也得到了证实(实验材料为不同品种的白藜麦种子，暂定静乐白-01)。然而，在前期的浸种探究中发现，红藜麦、黑藜麦的种子与白藜麦种子相比，无论在吸水还是萌发上都需要更长的时间，原因可能是不同颜色藜麦种子种皮品质有所差异。这也许预示着，不同颜色藜麦种子进行EMS诱变时，适宜条件有所不同。一般而言，红、黑种藜麦可能需要适当延长浸种或处理时间。但处理时间并不能无限延长。实验数据表明，当处理时间延长到12 h、14 h时，一些组合种子已经不萌发。Tropa-Castillo S J[23]的研究也发现，处理时间达到16 h之后，2% EMS浓度下发芽率显著降低，3%浓度下甚至表现为不萌发，这可能与藜麦对多余水分的敏感性有关。另外，尽管藜麦为抗逆性很强的植物，但EMS浓度也需控制在一定范围内。实验证明，较高浓度的EMS条件下，种子初始萌发时间和萌发高峰期延迟，发芽势和发芽率也随之降低甚至在整个统计周期表现不萌发。除此之外，藜麦种子进行EMS诱变处理时有必要选择较为适宜的温度。预实验发现，选择比本实验处理温度较高的28 ℃恒温处理，由于藜麦种子极易萌发的特性，种子平均只需要6～7 h即可萌发，诱变剂作用时间相对不充足；而置于4 ℃冷藏处理，对低温具有耐受性的藜麦种子平均需要48 h才能萌发，一些品种甚至不能萌发。低温下，尽管EMS的稳定性得以保证，但一定温度范围内，温度的升高，有利于突变频率的提高[30]，因此为了适当提升EMS的效用，本实验采用19～21 ℃室温处理，且预先浸泡2 h以增加藜麦种皮对诱变剂的通透性。综上，针对不同藜麦种子的诱变，需要在了解种子自身特性的基础上，对本实验适宜条件进行适当调整。

藜麦种子EMS诱变条件的初步确定，为开展藜麦种子诱变育种工作提供了参考，也为人工诱变创制和改良藜麦种质资源工作奠定了实验基础。然而在实验条件下，除了要考虑半致死率之外，还需要综合考虑M1、M2代等的畸变率；实际生产中，也要考虑浸泡种子出苗率等因素，从而选择合适的处理条件进行定向选择。