JNK信号通路在横纹肌溶解致急性肾损伤中的作用及桦木酸的干预效应

张超

横纹肌溶解症(RM)是指因挤压、运动、药物等原因所致横纹肌破坏和崩解，引起内环境紊乱、急性肾损伤(AKI)等组织器官损害的临床综合征[1]。AKI是横纹肌溶解的严重并发症，主要表现为肾功能异常和尿量减少，水电解质及酸碱平衡紊乱加重，其致病机制包括肾缺血再灌注、肌红蛋白的直接毒性和管型形成等。RM致AKI发病率较高，目前治疗方法主要有补液、纠正电解质紊乱和血液透析等，缺乏足够的药物治疗手段。

c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路是丝裂酶原活化蛋白激酶信号(MAPKs)转导通路家族的成员之一，参与多种肾脏疾病。在AKI方面，研究表明JNK信号通路在缺血再灌注、顺铂致AKI等模型中被激活并加重损伤，使用JNK抑制剂可起到肾保护作用[2-3]，但JNK在RM致AKI方面的作用尚未见报道。桦木酸(BA)属于羽扇豆烷型五环三萜类物质，广泛分布于桦木科植物中。中国传统医学中，桦树皮可用于黄疽、乳痈、疥疮等疾病的治疗[4]。现代医学研究证明，桦木酸在缺血和脓毒症引起的肾脏损伤中具有治疗作用[5-6]，对RM致AKI可能也有治疗作用，但具体效果和机制需要实验证明。

本研究采用甘油肌注法建立大鼠RM致AKI模型，探讨损伤后肾脏JNK通路的变化，以及桦木酸的干预效应，为深入认识RM致AKI的发病机制及探索新的治疗靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和材料 选取清洁级健康成年雄性Wistar大鼠32只，体质量190～210 g，8周龄，均购自河北医科大学实验动物中心。所有大鼠饲养环境为在空调室中，12 h明暗循环，温度(22±2)℃和相对湿度(50%～60%)保持恒定，所有动物实验符合实验动物福利伦理原则。

主要试剂为桦木酸(西安昊轩提供)、JNK通路拮抗剂SP600125(美国Sigma提供)、兔抗鼠p-JNK多克隆抗体(美国CST提供)、兔抗鼠JNK多克隆抗体(美国CST提供)、兔抗鼠Cleaved Caspase-3多克隆抗体(美国CST提供)、兔抗鼠NF-κB多克隆抗体(美国CST提供)、检测IL-1β的ELISA试剂盒(美国Sigma提供)、过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(美国KPL提供)、BCA检测试剂盒(上海生工提供)。如无特殊说明，其余试剂均购自上海碧云天公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及模型建立：将实验大鼠随机分为4组：正常对照组(C，n=8)，甘油肌注组(G，n=8)，甘油+桦木酸组(GB，n=8)，甘油+SP600125组(GS，n=8)。桦木酸和SP600125均使用10%二甲基亚砜(DMSO)稀释。为了排除溶剂的干扰，对C组给予腹腔注射10% DMSO 10 ml/kg，1 h后双侧后肢肌内注射生理盐水10 ml/kg，不给予药物干预。G组、GS组和GB组分别于腹腔注射10% DMSO 10 ml/kg、SP600125 15 mg/kg和桦木酸50 mg/kg，1 h后均给予双侧后肢肌内注射50%甘油10 ml/kg。桦木酸、SP600125和甘油的给药剂量及时间参照相关文献确定[7-9]。从注射生理盐水/甘油开始计算，24 h后处死大鼠。将各组大鼠给予戊巴比妥(60 mg/kg)腹腔麻醉后下腔静脉取血，获取肾脏组织。

1.2.2 肾功能指标及肾IL-1β水平检测：血肌酐(Cr)、尿素(BUN)采用全自动生化分析仪测定，肾脏IL-1β水平采用ELISA法测定，操作均严格按照产品说明书进行。

1.2.3 肾脏病理学检查：将肾脏组织使用多聚甲醛(4%)固定，石蜡包埋，取4 μm切片行HE染色，光学显微镜下观察肾脏组织病理学改变。在病变明显处用400倍镜观察，根据已报道的评分系统进行肾小管损伤半定量评分[10]。小管损伤的定义是上皮细胞坏死裂解、小管扩张、管型形成、细胞碎片脱落进小管腔或基底膜暴露。损伤评分由受损伤小管所占的比例确定，0分：无损伤；1分：<20%；2分：21%～50%；3分：>50%；4分：所有上皮细胞完全破坏。每个标本在皮质和外髓部随机观察10个视野，取平均值作为得分结果。

1.2.4 Western Blot：使用Western Blot测定肾脏磷酸化JNK(pJNK)、JNK、Cleaved、Caspase-3和NF-κB的表达。取部分肾皮质，用含蛋白酶及磷酸酶抑制剂的裂解液处理后进行冰上研磨，2 000 g 4 ℃离心10 min，取上清液，采用BCA法测定蛋白浓度。再取等量的组织蛋白，于100 ℃变性8 min后，10% SDS-PAGE凝胶电泳，转入PVDF膜。再用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别与特异性磷酸化pJNK(1 ∶1 000)、JNK(1 ∶500)、Cleaved Caspase-3(1 ∶1 000)和NF-κB(1 ∶1 000)抗体4 ℃孵育过夜。加入羊抗兔二抗(1 ∶10 000稀释)室温孵育2 h，ECL化学发光法显影，X线片曝光成像。蛋白条带的吸光度值测定采用ImageJ定量分析软件，GVPDH为内参照，测定蛋白的相对表达水平。

2 结 果

2.1 大鼠血肌酐、尿素变化 与C组比较，其余3组血清肌酐、尿素均明显升高(P<0.05)；与G组比较，GB组、GS组血清肌酐、尿素均降低(P<0.05)；与GS组比较，GB组肌酐水平更低(P<0.05)，而尿素水平无明显差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血肌酐、尿素水平比较

2.2 肾脏病理变化 C组大鼠肾脏外观颜色暗红、饱满、大小正常，其余各组大鼠肾脏呈现不同程度的紫红色，体积略增大。HE染色后使用光镜观察发现，C组大鼠肾组织无明显异常。G组大鼠可见肾小管明显扩张变形，管腔内可见细胞碎片，上皮细胞坏死或脱落，部分细胞核深染、固缩，少数肾小管管腔内可见管型。与同期G组比较，GB组和GS组大鼠肾病理损伤评分降低，其中GB组较GS组降低更加明显(P<0.05)。各组大鼠肾损伤评分见表2，肾脏病理变化见图1。

图1 各组大鼠肾脏病理变化(HE染色×400)

表2 各组大鼠肾损伤评分比较分)

2.3 肾组织IL-1β和NF-κB/GAPDH变化 Western Blot及ELISA结果显示：C组大鼠IL-1β和NF-κB含量较低；与G组大鼠相比，GB组和GS组大鼠IL-1β和NF-κB水平均下降(P<0.05)；与C组大鼠相比，其余各组大鼠IL-1β和NF-κB水平均上升(P<0.05)。与GB组大鼠相比，GS组大鼠IL-1β和NF-κB降低更加明显(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠IL-1β和NF-κB/GAPDH变化比较

2.4 肾组织pJNK、JNK和Cleaved Caspase-3变化 Western Blot结果显示，各组大鼠之间JNK表达显示无明显差异。C组pJNK和Cleaved Caspase-3少量表达。与C组大鼠相比，其余3组大鼠pJNK/JNK和Cleaved Caspase-3/GAPDH比值均上升(P<0.05)。与G组大鼠相比，GB组和GS组大鼠pJNK/JNK和Cleaved Caspase-3/GAPDH比值均降低(P<0.05)。与GS组大鼠相比，GB组大鼠pJNK/JNK比值较高(P<0.05)，但Cleaved Caspase-3/GAPDH比值较低(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠pJNK/JNK和Cleaved Caspase-3/GAPDH变化比较

3 讨 论

多种遗传性或获得性疾病都可导致横纹肌损伤，常见病因包括严重挤压、过度训练、服用他汀类药物等。这些因素导致肌细胞膜完整性发生改变，继而肌细胞内容物如肌红蛋白、肌酸激酶、离子和小分子物质释放入血，导致肌肉疼痛肿胀，出现电解质紊乱和AKI等[11]。特别是血浆肌红蛋白水平在短时间内迅速升高，通过肾小球滤过膜进入肾小管，导致过氧化反应、炎性反应和肾小管堵塞。AKI是横纹肌溶解最常见的严重并发症，肾脏功能损伤可进一步加重患者水电解质及酸碱代谢的紊乱。如不及时处理，患者可出现呼吸衰竭、弥散性血管内凝血甚至多脏器功能衰竭等严重后果。

甘油相对分子质量为92.09，具有较高的渗透压，根据溶液热力学相关定律计算，体积比为2.6%的甘油水溶液与血浆等渗。将50%甘油水溶液注射入大鼠后肢肌肉后，引起肌细胞的损伤和崩解，导致肌细胞内容物释放入血。既往研究在横纹肌损伤24 h后，肾脏的结构和功能损伤较为明显[9]，因此本研究将注射甘油后24 h作为观察时点。Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，在细胞凋亡中起着不可替代的作用，Cleaved Caspase-3是其活化形式，组织Cleaved Caspase-3表达水平和细胞凋亡率呈正相关。NF-κB是炎性反应的重要因素，可调节多种细胞因子，参与炎性反应放大与延续。IL-1β为一种致炎细胞因子，广泛参与人体组织中的炎性反应。故本实验采用Cleaved Caspase-3代表肾脏细胞凋亡程度，采用NF-κB和IL-1β反映肾脏炎性反应水平。

MAPKs属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是由广泛的细胞外刺激激活的关键信号转导酶，可将各种细胞外信号转化为细胞内反应。根据活化部位的序列不同，常见的MAPKs主要有ERK1/2、JNK、P38和ERK5共4条途径[12]。磷酸化是此类激酶的活性形式，正常情况下，这些激酶活性较低，但是在应激条件下会显著增加，影响下游多种效应因子。这些酶具有不同的生物学功能，包括核小体的调节和基因表达，mRNA稳定性及细胞增殖和存活[13]。MAPKs参与各种原因引起的急性肾损伤，但相关研究结果并不一致。JNK又被称为应激活化蛋白激酶(SAPK)，分为3种同工型：JNK1和JNK2具有广泛的组织分布，而JNK3主要局限于神经元组织、睾丸和心肌细胞[14]。JNK通路参与多种肾脏疾病，在AKI方面，有研究表明JNK通路在缺血再灌注、顺铂致急性肾损伤等模型中被激活，使用JNK抑制剂可起到肾保护作用[2-3]，但在横纹肌溶解致急性肾损伤模型中的变化和作用尚未得到验证。SP600125是目前较为常用的JNK广谱抑制剂，可通过选择性竞争ATP位点阻止其活化。在本实验中，给予甘油肌注后，大鼠pJNK/JNK比值明显升高。给予SP600125干预后，pJNK/JNK比值明显降低，同时NF-κB和IL-1β减少，肾损伤减轻，肾功能改善。这表明在RM致AKI中，JNK被激活，并可通过诱导炎性反应加重肾损伤。SP600125通过抑制JNK的激活减轻这一效应。

桦木酸广泛分布于桦木科植物中，以白桦树皮含量为高[15]，白桦树皮可用于治疗黄疽、乳痈、疥疮等疾病。现代研究证明，桦木酸具有优越的抗肿瘤和抗HIV活性，还具有抗炎、免疫调节、抗氧化应激等多种生物活性[4]。