多指标正交试验法优选葛根不同切制工艺研究

★ 邓小燕 钟凌云 朱卫丰 于欢 谌瑞林 廖晶晶 丁星月（.江西中医药大学 南昌330004；.江西江中中药饮片有限公司 江西 九江 33300）

葛根为豆科多年生藤本植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根，主产于河南、陕西、广东等地，味甘、辛，性凉，为不规则厚片、粗丝或边长为5～12 mm的小方块，具有疏散退热，透疹，生津止渴，升阳止泻，伸经活络，解酒毒等功效［1］。目前市场上葛根丁块多为1 cm的不规则丁块，葛根厚片则根据原药材的粗细被切成斜片或直片，药房和医院为了便于调剂和煎煮，一般选用葛根丁块，只有少部分药企会选择葛根厚片，葛根丁块、厚片的使用比例大概是9∶1。有大量研究表明，饮片切制规格的不同对其有效成分的含量及药效具有显著的影响［2-5］，但目前未见对葛根不同切制规格饮片进行比较的系统研究报道。因此，本实验拟开展葛根不同切制规格饮片的系统研究，首先就是对其不同切制规格的饮片工艺进行优选，为后续的深入研究制备标准样品，为今后进一步规范和提高葛根饮片质量，提高葛根饮片临床疗效奠定基础。

葛根主要活性成分为异黄酮类，其中最主要的有效成分为葛根素［6］，张文军［7］研究表明，药材浸出物的含量可以作为其质量标准的内容，而中药煎煮是患者选择中医中药治疗服药前的最后一个、也是至关重要的环节，但是目前包括《中国药典》在内的大部分规范及研究中并未见葛根煎出物指标，钟燕珠等［8］认为，药材的切制规格对其煎出量具有明显的影响，故本研究在考察葛根不同规格切制工艺中增加了煎出物这一指标。

本实验采用正交试验法,以切制厚度（片型饮片）/粒径（丁块饮片）、干燥时间、干燥温度为考察因素，以葛根浸出物、葛根素含量、煎出物作为优选指标，分别对葛根丁块、厚片的切制工艺进行考察，用加权法平均优选出葛根片/丁块的最佳切制工艺，为葛根的进一步研究和临床使用提供依据和参考。

1 仪器与试药

ZNHW型电热套（巩义市予华仪器有限责任公司）；waters2695高效液相色谱仪,检测器为紫外检测器；葛根素对照品（批号：10171-201303，南昌贝塔生物科技有限公司）。葛根原药材（批号：20180810,购于湖北黄冈），经江西中医药大学葛菲教授鉴定为豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根。无水乙醇（分析纯，西陇科学股份有限公司），甲醇（色谱纯，美国天地有限公司），磷酸（西陇科学股份有限公司），水为超纯水。

2 方法与结果

取葛根原药材，拟采用正交设计法优选工艺，以切制厚度/粒径、干燥时间、干燥温度为考察因素，以葛根浸出物、葛根素含量、煎出物作为优选指标，分别对葛根丁块、厚片的切制工艺进行考察。

2.1 葛根不同切制工艺样品的制备 按照因素水平表（表1～2），以切制粒径/厚度、干燥时间、干燥温度为考察因素，依据正交表，依次得到葛根丁块、葛根厚片各9种不同切制工艺样品。

表1 葛根丁块不同切制工艺正交试验因素水平表

表2 葛根厚片不同切制工艺正交试验因素水平表

2.2 葛根不同切制工艺样品浸出物测定［1］将不同切制工艺葛根样品打粉，过二号筛。取粉末2 g，精密称定，置于250 mL锥形瓶中，精密加入50 %的乙醇50 mL，密塞，称定重量，静置1 h后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 h。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量，得出浸出物含量。

2.3 葛根不同切制工艺样品煎出物的测定［9］取葛根丁块及厚片不同切制工艺干燥样品5 g，分别加10倍量水浸泡0.5 h后煎煮并保持微沸30 min，过滤至已经恒重的蒸发皿中，再加入8倍量水煎煮并保持微沸20 min，滤过，合并两次滤液，回收多余水分得浸膏，放105 ℃中干燥3 h后冷却，称重，计算得煎出率。

2.4 葛根素含量测定

2.4.1 色谱条件 Waters SymmetryC18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流动相为甲醇-0.2 %磷酸,流速为1 mL/min,检测波长为250 nm，柱温为25 ℃。理论塔板数按葛根素峰计算应不少于4 000，色谱图见图1。

图1 葛根炮制品及标准品的葛根素HPLC图

2.4.2 线性关系考察 精密吸取上述标准品溶液66、166、333、500、666、1 000 μL 分别置 1 mL容量瓶中，精密加入30 %乙醇至刻度，摇匀后进样，进样量为10 μL，色谱条件如“2.4.1”，X为葛根素浓度（mg/mL）,Y为葛根素峰面积,用Excel软件绘制标准曲线并计算线性范围。得回归方程Y= 4×107X-327319（R2= 0.999 8）,线性范围为1.5～7.5 mg/mL。葛根素的含量测定经方法学考察符合测定要求。

2.4.3 精密度试验 精密吸取葛根素标准品溶液10 μL，重复进样 6次,考察葛根素色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的一致性。测得葛根素峰面积 RSD=0.8 %,表明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性试验 精密取同一样品6份,制得供试品溶液,分别进样10 μL,测得葛根素峰面积RSD=0.7 %（n=6），表明该法重复性良好。

2.4.5 稳定性试验 取同一供试品溶液,每次进样10 μL,每1 h进样1次,连续6次。考察葛根素色谱峰的相对保留时间及相对峰面积在6 h内的稳定性。测得葛根素含量RSD＝0.35 %（n=6），表明供试品溶液中葛根素在6h内含量稳定。

2.4.6 加样回收率试验 精密称取已知葛根素含量的葛根粉末（葛根素含量为5.04 %）约100 mg,加5.0 mL葛根素对照品溶液（0.1 mg/mL）,计算加样回收率。结果葛根素的平均回收率为99.01 %，RSD=4.55 %。

2.4.7 标准品溶液的测定 精密称定葛根素标准品7.5 mg，置5 mL的容量瓶中，加30 %乙醇制成每1.5 mg/mL的溶液，摇匀。进样量为10 μL，色谱条件如“2.4.1”。

2.4.8 供试品葛根素的测定 精密称定葛根样品粉末（过三号筛）约0.1 g，置150 mL具塞锥形瓶中，用移液管精密加入30 %乙醇50 mL，称定重量，至水浴锅中加热回流30 min，待冷却后称重并补足减少的30 %乙醇溶液，摇匀后过滤，取滤液，进样量为 10 μL，色谱条件如“2.4.1”。

2.5 正交试验结果分析 利用综合加权评分法确定最佳的炮制方法。具体权重为：葛根素为主要有效成分，其含量占权重40 %；浸出物和煎出物为评价饮片质量的重要指标，其含量各占权重30 %。打分方法为：各指标均为越高越好，故以含量最高的样品为100分，将各值换算成相应的分数，以此分数为基础，进行正交试验数据处理。

综合评分=（A/42.05）×0.3+（B/33.9）×0.3+（C/7.59）×0.4

式中A代表浸出物含量；B代表煎出物含量；C代表葛根素含量算得总分,见表3-5。

表3 葛根丁块不同切制工艺正交试验安排及结果

表4 葛根丁块正交试验方差分析

表5 葛根厚片不同切制工艺正交试验安排及结果

表6 葛根厚片正交设计方差分析

表7 葛根丁块、厚片不同切制工艺三个指标总平均值

由表3中极差R值及方差结果可知,影响葛根丁块质量的各因素作用的主次顺序为A＞C＞B,即切制粒径为主要影响因素，干燥温度为次要影响因素，干燥时间为最次要影响因素，表4中P＞0.05可见A、B、C三个因素对试验结果均无显著性意义，按照综合加权评分值越大越好的原则,最优组合为A2B3C1，即葛根丁块切制粒径为7～8 mm,干燥温度为60 ℃，干燥4 h；由表5中极值R可以看出，影响葛根厚片各因素作用的主次顺序为C≈B＞A，即干燥时间和干燥温度的影响力接近，切制厚度为次要影响因素，由表6可知， A、B、C三个因素对试验结果均无显著性意义，按照综合加权评分值越大越好的原则，最佳水平组合为A3B2C1，即葛根厚片厚度为4～5 mm,干燥温度为55 ℃，干燥1 h。

2.6 最佳方案的验证试验 分别取葛根100 g，按照“A2B3C1”和“A3B2C1”进行处理，重复3次，试验结果见表8、9。

表8 葛根丁块验证试验结果 %

表9 葛根厚片验证试验结果 %

2.7 讨论 葛根作为一味临床上十分常用的饮片，目前2015版《中国药典》尚未对其切制参数规范化，因此市场上葛根饮片规格不一，对葛根饮片的质量和临床使用疗效稳定产生了一定的影响，本试验旨在利用正交试验考察并明确葛根的切制工艺参数，为葛根饮片的优化和质量的提高提供试验参考和依据，同时，为葛根作用机制的深入研究奠定基础。

本研究可知，在醇溶性浸出物和水溶性煎出物方面，丁块较厚片分别提高3.02 %和1.38 %，或与葛根厚片较丁块表面积更大，随着干燥温度和干燥时间的增加导致成分的散失增加有关，而在葛根素的含量方面，厚片和丁块的含量未有显著性差异，综合可见，丁块较优于厚片；由表3可知，水溶性煎出物与丁块的表面积有关，表面积越小，煎出的效果越好，而醇溶性浸出物并不随着表面积的变小而提高，由此可以得出，水溶性煎出物和醇溶性浸出物并不绝对随着药材的表面积的减小而增大，或与其含有的淀粉等其他成分有关，综上由可得，饮片并非切的越薄越好，其质量与有效成分，与溶媒的接触面积等均有一定关系。

试验结果表明，影响丁块质量的主要因素为切制粒径的大小，干燥温度为次要影响因素，干燥时间为最次要影响因素，研究发现，当葛根丁块粒径为7～8 mm,干燥温度为60 ℃，干燥时间为4h时饮片质量最佳；影响厚片的主要因素为干燥时间和干燥温度，切制厚度为次要影响因素，研究发现，当葛根厚片厚度为4～5 mm,干燥温度为55 ℃，干燥时间为1 h时饮片质量最佳，且葛根丁块质量较优于葛根厚片，建议推广应用。

葛根切制工艺受众多因素影响，如软化时原药材的大小、软化时用水温度和体积以及天气温度、湿度等影响，且由于葛根干燥根质地坚硬，所需软化时间较长，因此，葛根多在产地加工中将药材趁鲜切制，后续将对趁鲜切制饮片和原药材软化后切制饮片进行相关的比较分析，对于进一步明确葛根切制工艺和规格，阐明其炮制原理，提升葛根饮片质量等具有重要意义。