高效液相色谱法测定不同杀青工艺咖啡叶茶的主要功能成分

练珊珊，姚思迁，汪艳霞，姚新转，2，吕立堂，2※

（1.贵州大学茶学院，贵州贵阳550025；2贵州大学农业生物工程研究院，2.山地植物资源保护与种质创新重点实验室（教育部），贵州贵阳550025）

咖啡与茶、可可并称为当今世界的三大饮料，饮用咖啡在欧美国家很普遍。咖啡豆在世界上广受欢迎，但咖啡树叶的价值反而被长期忽略[1]。咖啡树和咖啡食用的起源地公认在非洲，具体地区说法不一，但多数人认为在东非的文明古国埃塞俄比亚[2]。咖啡叶制成的茶在非洲部分地区食用历史有5个世纪[1]。研究表明，咖啡叶茶中含有大量的粗纤维、儿茶素以及咖啡因等物质，其中的抗氧化物含量比咖啡、绿茶和红茶高出许多，可即刻舒缓饥饿和疲劳感，同时可使头脑清醒，提振精神[3]。咖啡叶茶中含有丰富的酚类化合物，如绿原酸。Nishi等[4]发现绿原酸可以显著降低胆固醇，预防动脉硬化等疾病。另外，咖啡叶茶还含有较多的芒果苷，具有抗炎、抗糖尿病、抗高脂血症、抗氧化，抗微生物和神经保护等作用[5]。比起咖啡和茶，咖啡叶茶不但咖啡因含量低苦味淡、味道温和，还含有许多有益健康的活性成分[6，7]。前期研究中，有研究人员参照晒青绿茶的加工工艺制备咖啡叶茶[8]，也有以夏季咖啡树鲜叶为原料，参照白茶、绿茶、乌龙茶和黑茶工艺研究开发咖啡叶茶[9]。但对咖啡叶茶制作的工艺参数、化学物质和品质形成机理等报道较少。为此，本研究通过高效液相色谱法（HPLC）、感官审评试验和自由基清除试验等研究探讨了3种杀青工艺的咖啡叶茶，确定了咖啡叶茶加工的可行性，分析比较了成分含量的差异和成因，以期为咖啡叶茶的提质加工和咖啡树资源的综合利用提供科学依据，可增加咖啡叶茶在市场上的竞争力，推动咖啡叶茶的加工和销售。

1 材料与方法

1.1 原料

咖啡（Coffea arabica L.）树鲜叶（2019年6月采自贵州省东南部农作物农场）由两片叶子和少量芽组成。所有标准品咖啡因（坛墨质检，货号：A1905476）、儿茶素（上海安谱实验科技股份有限公司，货号：07420050）、绿原酸（ANPEL，货号：L1240025）、葫芦巴碱（成都植标化纯生物技术有限公司，货号：190606）、芒果苷（南京源植生物科技有限公司，批号：Y2112820）、芦丁（如吉生物科技股份有限公司，货号：STA102）纯度均大于98%。甲醇、乙腈均为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 咖啡叶茶的制备参考常规绿茶的加工方法:摊晾→杀青→揉捻→干燥4个步骤。鲜叶摊晾10 cm左右的厚度，室温28℃摊晾3 h左右，每隔30 min翻动1次，直至鲜叶含水量降至70%左右进行下一步杀青。采用3种不同的杀青方法：滚筒杀青、微波杀青和蒸汽杀青，具体杀青参数见表1。杀青至适度，趁热揉捻，适当破坏叶组织，使汁液附着叶面，揉捻时间20min。揉捻好的咖啡叶放入烘干机中，在60℃烘30 min，得到3种不同杀青工艺的咖啡叶成品茶。

表1 不同杀青工艺相关参数Table 1 Parameters of different fixation technology

1.2.2 感官审评方法参照GB/T 23776-2009茶叶感官评价方法，采用五因素法从外形25%和内在品质（汤色10%、香气25%、滋味30%、叶底10%）对3种咖啡叶茶进行感官审评。按照百分制，由5位专家审评。

1.2.3 内含成分分析使用Shimadzu LC-20AT HPLC分析仪（日本Shimadzu Corporation，日本京都）进行高效液相色谱法分析，该色谱仪配备有CTO-10AS VP柱温箱，SIL-20A自动进样器，LC-20AT泵和SPD-20A紫外光谱检测仪。使用Agela Technologies Venusil XBP-C18色谱柱（4.6 150 mm，5m）进行分离。咖啡因含量的检测参照食品安全的国家标准方法（GB 5009.139-2014）；儿茶素含量的测定参照食品安全的国家标准方法（GB/T8313-2018）；绿原酸含量的测定参照食品安全国家标准法（GB/T 22250-2008）；葫芦巴碱的检测参照实验室已建立的方法[10]；芦丁的检测参照实验室已建立的方法[11，12]；芒果苷的检测参照实验室已建立的方法[13，14]。将咖啡叶茶磨碎后制备供试品溶液，使其能过0.45m的微孔滤膜。葫芦巴碱、芦丁和芒果苷的供试品溶液前处理方法根据实际情况做出以下优化，葫芦巴碱，称取样品0.5g于25mL容量瓶中，加50%甲醇适量，浸泡1 h，超声45 min，定容至刻度，摇匀，过0.45m滤膜上机；芦丁，称取0.5g，置于索氏提取器中，用石油醚（60～90℃）提取脂溶性成分，弃去石油醚提取液，剩余物挥去石油醚，再以甲醇加热回流提取1.5 h并定容，过0.45m滤膜待用；芒果苷，称取样品0.5 g于20 mL容量瓶中，加入稀乙酸18 mL，超声30 min，放冷后定容至刻度，摇匀，过0.45m滤膜待用。

1.2.4 清除自由基活性测定 用Jelena等[15]开发的方法测定DPPH清除活性。制备0.2 g/L的DPPH溶液，并用乙醇稀释至吸光度0.70±0.01。取2 mL的咖啡叶茶浸提液和5 mL稀释的DPPH溶液混合，在黑暗中放置30 min以彻底反应，然后在517 nm处测量混合物的吸光度，以抗坏血酸作为参照比较效果，计算样品的DPPH清除活性为每克样品干重所对应的抗坏血酸量（mg）。由QUIROGA（2013）[16]和SIGER（2015）[17]开发的方法用于确定ABTS清除活性，将7mmol/L ABTS溶液和4.9 mmol/L过硫酸钾溶液等量混合，然后在黑暗中反应12 h，然后用乙醇将混合物溶液稀释至吸光度为0.70±0.01，取2 mL样品提取物和5 mL稀释的ABTS溶液混合，在黑暗中反应7 min，然后在734 nm处测量混合物的吸光度，以抗坏血酸作为参照比较效果，计算样品的DPPH清除活性为每克样品干重所对应的抗坏血酸量（mg）。

2 结果与分析

2.1 杀青方式对咖啡叶茶感官品质的影响

3种咖啡叶茶样品经感官审评，结果见表2。咖啡叶制成的饮品茶气味清香，滚筒杀青的咖啡叶茶不但香气更为清香纯正，而且滋味口感也比微波咖啡叶茶和蒸汽杀青茶更为醇正浓厚。但微波杀青的咖啡叶受热均匀迅速，在外形色泽上比起滚筒杀青咖啡茶和蒸汽杀青咖啡茶更为完整明亮。滚筒杀青咖啡叶受蒸汽杀青后更为湿润，揉捻时叶边缘略有破损，外形和叶底评分低于微波杀青。就综合评分可以看出，滚筒杀青88.95＞微波杀青87.35＞蒸汽杀青86.20，说明咖啡树叶的加工可以在传统绿茶工艺中的杀青环节里采用滚筒和微波杀青，以得到滋味、香气、品质和外形色泽更优的咖啡叶茶。

表2 不同杀青方法对咖啡叶茶感官品质的影响Table 2 Results of different fixation methods on sensory quality of coffee leaves tea 单位：%

2.2 杀青方式对咖啡叶茶功能成分的影响

在不同的预处理方法和色谱条件下，通过HPLC检测微波、蒸汽和滚筒3种不同杀青工艺制成的咖啡叶茶。如图1所示，在278 nm、272 nm、257 nm、258 nm、265 nm和327 nm处的波长下检测到儿茶素、咖啡碱、芦丁、芒果苷、葫芦巴碱和绿原酸标品，且色谱图的峰响应高，基线稳定，峰形良好。以峰面积为纵坐标、标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，根据回归方程和色谱峰面积计算求得各物质的含量。结果见表3，重复3次，取平均值。咖啡碱的含量为滚筒杀青（6.71±0.27）mg/g、微波杀青（6.74±0.16）mg/g、蒸汽杀青（6.86±0.89）mg/g。葫芦巴碱含量为：滚筒杀青（4.55±0.14）mg/g、微波杀青（4.73±0.25）mg/g、蒸汽杀青（4.75±0.29）mg/g。芦丁含量为滚筒杀青（0.033±0.003）mg/g、微波杀青（0.028±0.005）mg/g、蒸汽杀青（0.025±0.002）mg/g。儿茶素的含量为滚筒杀青（21.8±0.75）mg/g、微波杀青（23.5±0.48）mg/g、蒸汽杀青（22.9±0.53）mg/g。绿原酸的含量为滚筒杀青（39.5±0.61）mg/g、微波杀青（35.1±0.38）mg/g、蒸汽杀青（34.6±0.26）mg/g。芒果苷的含量为滚筒杀青（8.67±0.26）mg/g、微波杀青（7.97±0.19）mg/g、蒸汽杀青（8.88±0.24）mg/g。从图2中可以看出，不同的杀青工艺的对3种咖啡叶茶中咖啡碱和葫芦巴碱的含量影响不大，差异不显著（P＞0.05）；但是对于儿茶素、绿原酸和芒果苷这几种多酚类的抗氧化物质的含量有影响，差异显著（P＜0.05）；芦丁含量极少，差异不显著（P＞0.05）。滚筒杀青制作的咖啡叶茶中绿原酸的含量比起微波杀青和蒸汽杀青来说含量最高，而在蒸汽杀青咖啡叶茶中，芦丁、儿茶素、绿原酸这几种活性物质的保留量都是低的，说明不同杀青工艺对于咖啡叶茶中刺激性的生物碱成分影响不大，但是对于多酚类抗氧化物质成分的含量影响大，滚筒杀青和微波杀青比起蒸汽杀青工艺能够更好的保留咖啡叶茶中抗氧化成分。

图1标准品HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromat ogrammap of reference substance

表3 咖啡叶茶六种功能成分含量Table 3 The content of six functional components of coffee leaves tea 单位：mg/g

图2三种杀青方式咖啡叶的功能成分柱状图Fig.2 Histogram of functional components of coffee leaves in three fixation ways

2.3 杀青方式对咖啡叶茶自由基清除活性影响

对不同杀青工艺下制成的咖啡叶茶进行提取，对其提取液的DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力进行测定，结果见表4，以抗坏血酸为参照，计算出3种不同杀青方式的咖啡叶茶样品的DPPH自由基清除能力为滚筒杀青（48.5 mg.Vc/g）＞微波杀青（46.2 mg.Vc/g）＞蒸汽杀青（45.8 mg.Vc/g），ABTS自由基清除能力为滚筒杀青（65.7 mg.Vc/g）＞微波杀青（58.8 mg.Vc/g）＞蒸汽杀青（56.5 mg.Vc/g），可以看出3种咖啡叶茶的水提物均具有良好的抗氧化活性，且对水溶性ABTS自由基的清除能力明显高于脂溶性DPPH自由基清除能力。图3显示了不同咖啡叶中的6种有效成分含量和自由基清除活性的趋势，可以看出多酚类的累积量最高（尤其是绿原酸和儿茶素）。在3种不同杀青方式的咖啡叶茶中绿原酸，儿茶素和芒果苷的含量都排在前3位，其次才是生物碱类，芦丁的含量极少。滚筒杀青咖啡茶的绿原酸含量比微波和蒸汽都要高很多，且差异显著。而蒸汽杀青咖啡茶的绿原酸含量在3种茶中的保留量都最低，这与我们的DPPH和ABTS自由基清除能力的趋势有一致性，蒸汽杀青咖啡叶茶的自由基清除能力最低。

表4 3种杀青咖啡叶DPPH和ABTS自由基清除能力Table 4 DPPH and ABTS radical scavenging ability of threefixation in coffee leaves 单位：mg.Vc/g

图3功能性成分和自由基清除率对比趋势图Fig.3 Trend chart comparing functional ingredients and radical scavenging rate

3 讨论

从实验结果可以看出，滚筒杀青咖啡叶茶除了外形、叶底偶有不均，在汤色、滋味、香气和内含成分各方面都表现优越。滚筒杀青金属导热，叶温升温快，但受热欠均匀，可能导致少部分焦点糊边，叶底不均匀[18]。微波杀青咖啡叶茶在外形汤色叶底方面的表现都良好，但是香气和滋味较淡，多酚类物质也相对较高。这在朱德文等[19]绿茶杀青的加工研究中发现这种现象，另外在其他材料，如桑叶、蓝莓叶和金花茶等中也观察到类似现象[20-22]。微波杀青受热均匀，由叶内向叶表迅速升温，叶底匀整嫩绿明亮。蒸汽杀青咖啡叶茶涩味最强，可能是由于蒸汽杀青升温较慢，杀青时间较短，酯型儿茶素减少量少，蛋白质水解产生氨基酸增加量也少因此口感偏苦涩[23]。且蒸汽杀青揉捻的时候含水量高，揉捻的时候会揉碎部分叶边，导致叶底不够均匀。

在测定的6种品质成分中，其中生物碱类的物质咖啡碱和葫芦巴碱的含量差异不大，但多酚类的儿茶素、绿原酸和芒果苷的含量因杀青工艺的不同，其含量差异显著，芦丁含量极少，差异不显著。研究表明，“杀青”工艺最主要的就是利用高温“钝化”酶的活性，在后续揉捻烘炒过程中才能保证多酚类物质不会被酶促氧化分解[24]。生物碱类的物质性质较稳定[25]，在杀青过程中受酶促作用影响小，因此咖啡碱和葫芦巴碱成分含量变化不大。杀青的实质就是发生酶的热变性，这里的酶主要指的是多酚氧化酶和过氧化物酶，不同杀青方法酶热变性的程度和时间不同，对多酚类物质的酶促氧化作用不同[26]。儿茶素、绿原酸、芒果苷和芦丁都属于多酚类物质，因此不同杀青工艺处理会对咖啡叶茶中的儿茶素、绿原酸、芒果苷和芦丁的含量造成差异。咖啡树鲜叶在杀青过程中，处于湿热有氧条件，儿茶素极不稳定，易发生氧化、热解、聚合和转化等一系列作用而使其总量降低[27，28]。微波杀青是一种激化茶叶组织内部水分子高速运动而发热的杀青技术[29]，其升温迅速而均匀，使酶的热变性快，儿茶素被氧化分解得少，因此保留得芦丁、儿茶素和绿原酸含量多。滚筒杀青以铁为介质传热，金属导热性强，而且滚筒杀青时间较长，酶促作用完全被抑制，因此保留的绿原酸等物质含量高。

3种杀青方式的咖啡叶茶在自由基清除能力上的表现是滚筒和微波杀青咖啡茶无论是DPPH自由基清除还是ABTS自由基清除能力都比蒸汽杀青咖啡叶茶要更好。清除自由基是表征抗氧化能力的一个指标，抗氧化能力越强的咖啡叶茶中可能存在的抗氧化活性物质才会更多[30]。蒸汽杀青工艺的热量传递以水蒸汽为主，在水升温形成穿透力强的水蒸气过程中，水比热容大，升温慢，所需时间长[31]。温度对酶的催化是两重性的[32]，在开始温度还没达到使酶变性温度时，在这种高湿升温的条件下，反而酶促作用会更活跃，咖啡叶中的黄酮类、单宁类和植酸类物质的氧化缩合和水解程度会更高，保留率低[33]，因此反而蒸汽杀青咖啡叶茶的自由基清除能力比滚筒杀青和微波杀青低。

4 结论

3种不同杀青方式中，咖啡叶茶的咖啡碱和葫芦巴碱含量差异不大，芦丁的含量在3种杀青方式中含量都极少。滚筒杀青的咖啡叶茶滋味和香气好，但外形叶底欠匀整，保留的绿原酸含量最多，芒果苷等物质含量也相对高；微波杀青的咖啡叶茶外形、汤色和叶底各方面都表现出色，而且保留的绿原酸、儿茶素和芒果苷的含量都较高，但滋味和香气略淡；蒸汽杀青的咖啡叶茶在外形和内在品质上相对表现较差，在3者的自由基清除实验中，蒸汽杀青咖啡叶比起滚筒杀青和微波杀青也是最差的。因此，在咖啡叶茶的加工制作过程中，滚筒杀青和微波杀青在各方面都优于蒸汽杀青，可将这两种杀青方式根据不同产品需求引入咖啡叶茶的制作工艺，可以为咖啡叶茶的产业化生产提供参考。