人参雨生红球藻浓缩饮品延缓秀丽隐杆线虫衰老作用的研究

付书正，王彩霞，谭璐瑩，綦占文，高雪峰，李坤

（1.吉林大学药学院，吉林 长春130021；2.延边韩工坊健康制品有限公司，吉林 延吉133000；3.吉林省亿福健康产业集团有限公司，吉林 长春130021；4.吉林紫鑫药物研究有限公司，吉林 长春130041）

衰老是人体中不可逆的生物学进程，也是诸如心血管疾病、癌症、帕金森症和阿尔茨海默症等神经退行性疾病最主要的诱因[1-3]。秀丽线虫（Caenorhabditis elegans，C.elegans）蛋白质序列中约有83%与人类同源，具有良好的遗传学和清晰的生物学研究背景，其生命周期短，实验操作方便，是研究人体衰老的经典模式生物[4-6]。

人参雨生红球藻浓缩饮品（Ginseng Haematococcus Pluvialis Concentrated Drink，GHCD）（生产许可证编号：SC10622240148121；产品标准：Q/HGF 0353S）是以生晒参、黑果腺肋花楸果、蓝莓、桑椹、黑枸杞、乌梅、黑枣、黑加仑、覆盆子、黑蒜、胶原蛋白肽、雨生红球藻粉及壳寡糖等为原料，经提取、浓缩等工艺而制成。饮品为棕褐色液体，具有人参特有的气味和滋味，含人参总皂苷≥0.1%。雨生红球藻中含有的虾青素是一种抗氧化活性极强的物质，虾青素的抗氧化活性可应用于肿瘤、心血管疾病和糖尿病等预防中，还有提高免疫力、延缓衰老的作用[7，8]。生晒参含有的人参皂苷Rb1、Rg2、Rg3及CK等，经实验证明也都具有抗氧化和抗衰老的功效[9-12]。本实验借助模式动物秀丽线虫，通过对其寿命、热激反应、运动能力、产卵能力及体内抗氧化酶活力等方面进行观察，探究GHCD功能食品在其体内的抗衰老作用，为抗衰老的功能食品开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人参雨生红球藻浓缩饮品（GHCD，批号：20200721）由延边韩工坊健康制品有限公司提供；野生型秀丽线虫（Caenorhabditis elegans，C.elegans）及埃希氏大肠杆菌OP50（Escherichia.coli）均由吉林大学基础医学院病原生物学教研室提供；SOD试剂盒购自南京建成生物工程研究所（生产批号：20200818）。

SPX-70BIII型生化培养箱（天津泰斯特仪器有限公司）；FRESCO21高速冷冻离心机（Thermo公司）；SMZ-140体视显微镜（Motic公司）；GF36DA立式压力蒸汽灭菌锅[致微（厦门）仪器有限公司]；Epoch酶标仪（Bioteck公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 秀丽线虫的培养及同期化NGM（Nematode growth media）培养基配制[13]：琼脂4.0 g、蛋白胨0.5 g、NaCl 0.6 g，加蒸馏水100 mL溶解，摇匀，再加入1 mol/L MgSO4溶液以及1 mol/L CaCl2溶液各0.2 mL、KH2PO4缓冲液3.25 mL，摇匀后补足蒸馏水至200 mL，121℃高压蒸汽灭菌20 min，待冷却至60℃左右时，加入5 mg/mL胆固醇乙醇溶液0.2 mL，摇匀后倒入无菌培养皿内，取大肠杆菌OP50置于培养皿内于37℃培养过夜，备用。

取L4期野生型N2线虫涂布于大肠杆菌OP50的NGM培养基内，20℃培养48～72 h，观察其产卵情况，开始产卵4 h后，将L4期成虫挑去，将卵培养至L4期成虫，该批成虫即为同期化成虫。收集同期化线虫，随机分组。

1.2.2 对秀丽线虫衰老指标的检测挑取线虫置于不同浓度的GHCD（0.25、0.5和1.0 mg/mL）的NGM培养基，对照组给予等量的蒸馏水。每个实验均重复3次。

1.2.3.1 秀丽线虫寿命测定随机挑取线虫至涂有大肠杆菌OP50的NGM培养基上，每组30条，转移当天记为第0天，20℃培养，每天上午将线虫转移至新的同浓度培养皿内，同时观察线虫的存活情况。线虫死亡判断：以铂丝轻碰触秀丽线虫后10 s无反应；线虫剔除判断：线虫爬出培养皿或虫卵在体内孵化成袋样虫。每天记录秀丽线虫存活和死亡条数，实验持续至最后一条秀丽线虫死亡为止[14]。

1.2.3.2 秀丽线虫热应激测定随机挑取线虫各30条至给药组及对照组，20℃培养3 d。给药3 d后，封口膜封住培养皿，平铺放置于35℃培养箱中，恒温培养2 h；结束后解开封口膜，将培养皿放回20℃培养箱中恢复12 h。此时记为第0天。每天更换培养基同时观察并记录线虫的死亡情况，标准如上。

1.2.3.3 秀丽线虫运动测定随机挑取线虫各80条至给药组及对照组，此时记为第0天。分别于第3、5、7、9天，随机取20条线虫置于M9缓冲液的不接种大肠杆菌的NGM培养基中，2 min后观察3 s内每条线虫的移动情况（身体摆动定义为头或尾从一侧摆向另一侧）。

1.2.3.4 秀丽线虫产卵测定随机挑取线虫各1条至给药组及对照组，每组10皿，记为产卵第1天，每隔24 h将亲代线虫转移至新的NGM平皿中，在产卵高峰期（DAY1-DAY6）内，每天记录虫卵数目（产卵量）。

1.2.3.5 秀丽线虫体内抗氧化酶（超氧化物歧化酶，SOD）活力的测定随机挑取线虫至涂有大肠杆菌OP50的NGM培养基上，每组30条，20℃培养72 h，M9缓冲液将秀丽线虫从培养皿上冲洗下，清洗至透明后移除上清液称重，按比例加入生理盐水，在冰水中进行匀浆，匀浆2 500 r/min，离心10 min，按照试剂盒说明书要求进行SOD酶活力的测定[15]。

1.2.3 数据统计分析采用SPSS 22.0统计软件分析，实验结果采用“均值±SD”表示。采用方差分析进行两组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 对秀丽线虫寿命的影响

寿命是秀丽线虫衰老最直接的指标，GHCD对秀丽线虫寿命的影响实验结果（图1）表明，3个浓度加药组与对照组相比，寿命曲线均右移，说明GHCD对秀丽线虫的寿命有明显的延长作用。在第5天现象较明显，各浓度加药组中线虫的活跃程度明显强于对照组，最长寿命为18 d，从表1中的秀丽线虫平均寿命数值可以看出，与对照组相比，1.0 mg/mL加药组效果最佳，平均寿命为18 d，表明GHCD能延缓线虫衰老。

表1 GHCD对秀丽线虫平均寿命（均值±SD）的影响Table 1 Effect of GHCD on average longevity of Caenorhabditis elegans

图1 GHCD对秀丽线虫生存率的影响Fig.1 Effect of GHCD on survival rate of Caenorhabditis elegans

2.2 对秀丽线虫热激的影响

耐热的能力也是考察抗衰老的一种表现。高温条件下，各浓度的加药组与对照组相比，秀丽线虫平均寿命均延长，0.5 mg/mL加药组线虫平均寿命为8.67 d（表2），曲线明显右移，能增强线虫抗热应激的能力（图2）。给药3 d后，热激实验结果表明（图2），与对照组相比，实验组线虫存活率均有所提高。

表2 GHCD对秀丽线虫热激平均寿命（均值±SD）的影响Table 2 Effect of GHCD on heat stress of average lifespan of Caenorhabditis elegans

图2不同浓度的GHCD对秀丽线虫热应激损伤的影响Fig.2 GHCD at the concentration of 0.25，0.5，1.0 mg/mL had effect on heat stress injury of Caenorhabditis elegans

2.3 对秀丽线虫运动能力和生殖能力的影响

秀丽线虫的运动能力和产卵量与线虫的寿命具有直接相关性，能评价线虫的衰老速度，不仅能体现机体健康情况，还能反应神经系统的健康程度。在寿命和热应激试验中10%的饮品作用效果最佳，故选用此浓度检测线虫的运动能力和产卵量。从摆动实验结果可见，与对照组比较，从第5天开始，饮品能明显提高线虫的运动能力（图3 A）；产卵实验结果发现，与对照组比较，饮品从第3天开始能显著提高线虫的产卵量（图3B）；表明饮品对线虫的生殖能力有正向增强作用，可延缓线虫衰老。

图3（A）GHCD对秀丽线虫运动能力的影响；（B）GHCD对秀丽线虫产卵量的影响Fig.3(A)Effect of GHCD on movement of Caenorhabditis elegans;(B)Effect of GHCD on fecundity of Caenorhabditis elegans

表3 GHCD对秀丽线虫运动能力（均值±SD）的影响Table 3 Effect of GHCD on movement of Caenorhabditis elegans

表4 GHCD对秀丽线虫产卵量（均值±SD）的影响Table 4 Effect of GHCD on fecundity of Caenorhabditis elegans

2.4 对秀丽线虫体内SOD酶活性的影响

超氧化物歧化酶（SOD）作为线虫体内最主要的抗氧化酶，对机体的抗氧化水平至关重要，SOD能够有效清除超氧阴离子自由基，保护机体，起到抗氧化的作用[16]。秀丽线虫内的抗氧化酶活性越强，则GHCD起到的抗氧化作用越强。如图4所示，经测定，秀丽线虫体内的SOD值与给予GHCD的剂量成正比，与对照组相比，给药组秀丽线虫体内的SOD活性显著增加（P＜0.05）。由此能够说明给予GHCD后，在秀丽线虫体内起到抗氧化的作用，并且SOD值与GHCD呈剂量相关性。

图4不同浓度的GHCD对秀丽线虫体内SOD活性的影响（与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01）Fig.4 GHCD at the concentration of 0.25，0.5，1.0 mg/mL had effect on the activity of SOD of caenorhabditis elegans(*P＜0.05，**P＜0.01，vs control group)

3 结论

随着年龄的增长，人体内细胞间氧化剂水平会随之升高，则产生两个影响：对细胞产生损伤以及某些代谢通路的激活。活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）及其产物在生命活动中具有重要的作用[17]。如果ROS过量表达，则会对细胞内蛋白质、DNA等产生损伤，促进细胞向癌症细胞转变。细胞通过平衡ROS产生系统和SOD、过氧化物酶和谷胱甘肽的清除系统从而达到控制ROS水平的目的[18]。本研究通过利用秀丽线虫模型，探究GHCD抗衰老抗氧化的作用，实验证明，与对照组相比，1.0 mg/L的GHCD可以显著延长秀丽线虫的寿命，在热应激实验中增加线虫的存活率，并且显著增加其运动能力、产卵量以及在线虫体内的SOD活性，进而达到了延缓衰老的作用。人参雨生红球藻浓缩饮品中含有人参和雨生红球藻里提取的天然成分，具有抗氧化的活性，正是因为这些草本植物提取物的功效，与之前报道的雨生红球藻中提取的虾青素等具有强抗氧化的活性一致[19]。本实验借助秀丽线虫模型探究人参雨生红球藻浓缩饮品的抗衰老活性，为人参红球藻等提取成分在哺乳动物体内抗衰老研究提供思路，也为人参雨生红球藻的产品开发利用提供理论参考。