叶艺杂交兰的组培快繁技术研究

宋丹丹，朱鹏宇，黎文敏，俎俊蕊，曾瑞珍，2，谢利，2，郭和蓉，2，张志胜，2※

（1.华南农业大学林学与风景园林学院，广东广州510642；2.国家植物航天育种工程技术研究中心，广东广州510642）

杂交兰是采用国兰和大花蕙兰杂交选育的兰花新类型，集国兰和大花蕙兰的部分优良性状于一身，具有极高的经济价值、文化价值和广阔的市场前景[1]。叶艺杂交兰是指叶片上镶嵌着黄色或白色条纹和斑点的杂交兰，因其叶片带艺，观赏价值更高。组织培养快速繁殖是杂交兰种苗生产的主要途径，因此研究杂交兰组织培养快速繁殖技术对推动杂交兰种业和产业发展具有重要作用。目前对杂交兰组织培养快速繁殖已有一些研究报道[1-7]，但关于叶艺杂交兰的组培快繁技术研究未见报道。

‘小凤兰’是以‘大凤兰’为母本，‘企剑白墨墨兰’为父本杂交育成的墨兰型杂交兰新品种[8]。该品种株型似‘企剑白墨墨兰’，但与传统墨兰相比，其花期更长，花更大，组培快繁效率也更高，育成后很快就进入产业化开发。在‘小凤兰’种苗工厂化生产中筛选到3种叶艺突变体，本研究以其中2种突变体试管苗为材料，研究叶艺杂交兰的组培快繁技术，为加快叶艺杂交兰的新品种选育和产业化推广奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为‘小凤兰’（Cymbidium‘Xiaofeng’）银边覆轮艺突变体G1和青缟艺突变体G2试管苗，G1和G2叶艺突变体是作者从‘小凤兰’试管苗中选出。

1.2 试验方法

1.2.1 根状茎诱导选取生长健壮的试管苗，在超净工作台上用镊子和解剖刀切取2～3 mm茎尖，接种于MS+6 BA 1.5 mg L1+NAA 0.5 mg L1+活性炭0.5 g L1+10%椰汁+蔗糖30.0 g L1+卡拉胶7.5 g L1（pH=5.8～6.2）诱导培养基上，每瓶接种4个，8瓶为1次重复，重复3次，将培养瓶用封口膜封好后，装入黑色密闭塑料袋中，在温度为（26±1）℃的培养室中培养50 d，记录诱导形成根状茎和死亡的茎尖数，计算诱导率和死亡率。

1.2.2 根状茎增殖取继代培养的根状茎，在超净工作台上用镊子和解剖刀切成约1 cm长，接种于MS+6-BA 1.5 mg L1+NAA 0.5 mg L1+蔗糖30 g L1+卡拉粉7.5 g L1+活性炭0.3 g L1（pH=5.8～6.2）增殖培养基上，在（26±1）℃、光照强度5 mol m2s1、光照时间12 h d1的条件下培养40 d，每瓶接10条，5瓶为1次重复，重复3次，用电子天平称量每瓶接种的根状茎重量和培养40d后根状茎重量，记录褐化死亡的根状茎数，计算褐化死亡率和增殖系数。

1.2.3 根状茎分化取长约1 cm带生长点的根状茎，均匀接种于MS+6 BA 1.5 mg L1+NAA 0.1 mg L1+蔗糖30g L1+卡拉粉7.5g L1+活性炭0.05g L1（pH=5.8～6.2）分化培养基中，在温度（26±1）℃、光照强度10mol m2s1、光照时间12 h d1的条件下培养，每瓶接种10条，5瓶为1次重复，重复3次。培养40d后，记录分化出芽（长度≥0.5 cm）和带根苗的根状茎数以及每条根状茎分化出的芽（长度≥0.5 cm）和带根苗数，计算分化率、平均芽分化数和平均苗分化数。

1.2.4 生根壮苗将高4 cm左右的苗，均匀接种于1/2 MS+6 BA 0.1 mg L1+NAA 0.5 mg L1+蔗糖20 g L1+卡拉粉7.5 g L1+活性炭0.5 g L1（pH=5.8～6.2）生根壮苗培养基中，在温度（26±1）℃、光照强度15 mol m2s1、光照时间12 h d1的条件下培养，每瓶接种7条苗，5瓶为1次重复，重复3次。培养40 d后，测量株高、株幅、茎粗、叶片数、最长叶长、根数和最长根长。

1.2.5 试管苗移栽将试管苗从培养瓶中小心取出，用清水洗净根部，置于通风阴凉处晾干。用树皮、泥炭土、椰糠按1∶1∶1的比例混合基质种植于口径为5cm的黑色种植袋中，放在具双层遮阳网的温室中栽培，温室温度为5～32℃，相对湿度为30%～90%。刚移栽的试管苗用2 500倍液链霉素和800倍液恶霉灵灌根，一周内每天向叶面喷水，随后进入常规管理，观察记录试管苗的生长情况，记录死亡苗数，计算成活率。

1.3 统计分析

试验（处理接种外植体数量＞30个，重复3次）所有数据在Excel 2016中整理后采用SPSS 20软件进行统计分析，用Duncan's新复极差法进行多重比较。诱导率（%）=诱导出根状茎的茎尖数/接种茎尖数100%；增殖系数=培养后鲜重/接种鲜重；芽分化率（%）=分化出芽的根状茎数/接种根状茎数100%；平均芽分化数（个/条）=分化出的芽总数/接种根状茎数；苗分化率（%）=分化出苗的根状茎数/接种根状茎数100%；平均苗分化数（根/条）=分化出的苗总数/接种根状茎数；褐化死亡率（%）=死亡（褐化）的根状茎数/接种根状茎数100%；试管苗成活率（%）=成活试管苗数/移栽的试管苗总数100%。

2 结果与分析

2.1 ‘叶艺小凤兰’茎尖根状茎诱导

不同‘叶艺小凤兰’根状茎的诱导特性不同（图1）。培养50 d，G1的诱导率为40.74%，显著低于G2，而褐化死亡率为20.37%，显著高于G2（图1 A）；G2茎尖诱导形成的根状茎粗壮，而G1的弱小（图1 B），说明G2根状茎生长比G1快。

图1‘叶艺小凤兰’的根状茎诱导Fig.1 Rhizome Induction of Cymbidium‘Xiaofeng’with leaf color and pattern mutation

2.2 ‘叶艺小凤兰’根状茎增殖

基本培养基对‘叶艺小凤兰’根状茎增殖有影响，但对不同‘叶艺小凤兰’的影响不同。在暗培养条件下，G1根状茎在MS和1/2MS中的增殖系数没有显著差异，而G2根状茎在1/2 MS培养基中的增殖系数显著高于G1（图2A）。光照对‘叶艺小凤兰’根状茎增殖也有明显影响，G1根状茎在暗培养下的增殖系数显著高于5mol m2s1光照，而G2根状茎在黑暗和5mol m2s1光照下的增殖系数没有显著差异（图2 B）。

不同‘叶艺小凤兰’根状茎颜色和增殖系数不同，G1根状茎为绿色，而G2根状茎为黄绿色（图2 C），且增殖后产生的新根状茎颜色一致；在黑暗条件下培养，G1根状茎的增殖系数比G2高，而在光照下培养G2比G1高。

2.3 ‘叶艺小凤兰’根状茎分化

G1和G2根状茎芽分化率、苗分化率、平均苗分化数和褐化死亡率没有显著差异，但G2根状茎平均芽分化数显著高于G1（图3 A和B）。G1根状茎分化出的芽苗为淡绿色，叶片具银边覆轮艺，而G2的芽苗为淡黄绿色，叶片具青缟艺，两者的叶艺保持率均为100%（图3 B和D），说明G1和G2叶艺稳定。

图2‘叶艺小凤兰’的根状茎增殖Fig.2 Rhizome proliferation of Cymbidium‘Xiaofeng’with leaf color and pattern mutation

图3‘叶艺小凤兰’根状茎分化Fig.3 Rhizome differentiation of Cymbidium‘Xiaofeng’with leaf color and pattern mutation

2.4 ‘叶艺小凤兰’生根壮苗

不同‘叶艺小凤兰’生根壮苗特性差异明显（图4）。G1的株高为5.96±0.08 cm，显著低于G2，但两者株幅没有显著差异（图4 A）。G2的叶片数和叶长显著高于G1，但根数和芽数显著少于G1，而两者的根长没有显著差异（图4 B和C）。G1和G2的所有再生植株叶片均具有各自的叶艺，进一步说明其叶艺是稳定的（图4 D和E）。

图4‘叶艺小凤兰’的生根壮苗Fig.4 Strengthening of test-tube seeding of Cymbidium‘Xiaofeng’with leaf color and pattern mutation

2.5 ‘叶艺小凤兰’试管苗栽培

不同‘叶艺小凤兰’试管苗栽培特性差异明显（图5）。G1试管苗移栽30 d、60 d和90 d的成活率均显著低于G2，说明G2试管苗移栽后更易成活。

图5‘叶艺小凤兰’试管苗栽培成活率Fig.5 Survival rate of test-tube seeding of Cymbidium‘Xiaofeng’with leaf color and pattern mutation

3 讨论

叶艺兰具有重要的观赏价值和广阔的市场前景，越来越受到研究者的重视[9-13]。‘叶艺小凤兰’是墨兰型杂交兰‘小凤兰’的无性系变异材料。本研究结果表明，通过茎尖培养生产的‘叶艺小凤兰’试管苗叶艺稳定，在MS+6 BA 1.5 mg L1+NAA 0.5 mg L1+活性炭0.3 g L1培养基上黑暗培养40 d，银边覆轮艺G1和青缟艺G2根状茎增殖系数分别为2.36和2.28，在MS+6 BA 1.5 mg L1+NAA 0.1 mg L1+蔗糖30g L1+卡拉粉7.5g L1+活性炭0.05g L1培养基上，其芽苗分化率分别为114.00%和133.33%，90 d试管苗移栽成活率分别为87.56%和96.35%。研究结果可加快‘叶艺小凤兰’新品种审定和推广应用，对推动我国杂交兰育种和产业化发展具有重要意义。

叶艺兰在组培快繁过程中通常会出现返祖现象，导致其种苗生产效率降低[14-15]。本研究结果表明，银边覆轮艺G1和青缟艺G2的叶艺均可以通过组织培养快速繁殖稳定传递，这一结果与石乐娟等[16]在叶艺春兰‘绿云’、王玉英等[17]在辐照获得的叶艺兰新品系‘TRIR-2’中的研究结果一致。蒋彧等[18]研究结果表明，与‘隆昌素’相比，‘隆昌素’叶色突变体根状茎增殖和分化能力下降，试管苗长势缓慢。杨靖等[3]研究结果表明，在MS+6 BA 1.5 mg L1+NAA 0.5 mg L1+活性炭0.5 g L1培养基上培养，‘小凤兰’根状茎增殖系数为3.0；而本研究结果表明，银边覆轮艺G1和青缟艺G2‘小凤兰’根状茎增殖系数分别为2.36和2.28，进一步证明叶艺变异导致中间繁殖体增殖能力下降。