两种不同品种人参HPLC指纹图谱研究

侯淑丽，张晶晶，张宁，曲正义，李亚丽，侯微，郑培和※

（1.吉林省医药中等职业学校，吉林吉林130031；2.中国农业科学院特产研究所，吉林长春130112）

人参（Panax ginseng C.A.Mey.）为五加科人参属多年生草本植物，别名人衔、土精、地精和棒槌等，《神农本草经》列为上品，主要分布于我国东北、朝鲜、韩国、日本及俄罗斯远东地区[1]。人参是百草之王，地下根及根茎入药。人参具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血和安神益智等功效[2]。由于人参具有重要的药用价值，所以其需求量巨大。人参资源在滥采乱挖之下遭到严重破坏，1992年，人参被列为国家珍稀濒危植物，现在市场上销售的人参几乎都是人工种植品[3-4]。为了保证人参性状单一，质量稳定，科研人员开始进行人参品种选育工作，至今我国已选育十多个人参品种。这些人参品种在农艺性状、抗病性及产量等方面都有较大差别，它们在药材品质上是否有区别，需要深入研究。指纹图谱在中药质量控制检验中具有模糊性和整体性双重特点，能够在每个峰尚不明确情况下系统、整体、专属地表征中药所共有的内在特征，能够全面、有效地评价中药的内在质量[5-12]。因此，本实验利用中药色谱指纹图谱技术对其中两个主推品种进行分析，以期为人参品种鉴别和质量评价提供数据支持。

1 仪器与材料

1.1 仪器设备

安捷伦1200-6310高效液相色谱质谱联用仪，包括脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器和离子阱质量分析器（美国安捷伦公司）；KQ-500DE超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HC-2514高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；CP64电子天平（常州奥豪斯仪器有限公司）。

1.2 试剂与材料

乙腈、甲醇（色谱纯，Fisher公司）；乙酸铵、氨水（色谱纯，Sigma公司）；其它试剂为分析纯；实验用娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈有限公司）。实验材料采自中国农业科学院特产研究所左家北方药用植物资源圃，5年生，采集时间2018年9月，每个品种随机取10株。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent TC-C18（2）（250 mm 4.6 mm，5m）；流动相A为5 mM醋酸铵、1 mM氨水溶液，B为5 mM醋酸铵、1 mM氨水溶液-乙腈（1∶9），梯度洗脱：0～4 min，20%B；4～7 min，20%B-29%B；7～10 min，29% B-35% B；10～12 min，35% B；12～17 min，35%B-53.3%B；17～22 min，53.3%B-56.6%B；22～23 min，56.6%B-95%B；23～28 min，95%B；29～30 min，95%B-20%B；30～35 min，20%B。检测波长203 nm。体积流量1.0 mL/min；柱温为35℃；进样量20L；记录35 min内的色谱图。

2.2 供试品溶液的制备

分别取康美1号、福星1号两种不同人参品种各10株，洗净，45℃干燥，粉碎，过60目筛。精密称取人参粉末0.2 g，加入1 mL75%乙醇，混匀，放置过夜，超声提取30 min，12 000 rpm离心5 min，取上清液过0.22m有机滤膜，即得供试液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验取康美1号第2株供试液，按照“2.1”色谱条件重复进样6次，记录色谱图。

2.3.2 重现性试验取康美1号第2株样品粉末6份，分别按“2.2”项下方法制备供试液，各取20L进样，记录色谱图。

2.3.3 稳定性试验取康美1号第2株样品溶液，于制样后0、4、8、12、24、48 h按照“2.1”色谱条件，吸取20L进样，记录色谱图。

2.4 共有峰的选择

在相同的色谱条件下，不同批次的人参色谱图所共同具有的色谱峰即为共有峰。根据色谱数据计算指纹图谱中的共有峰。

2.5 指纹图谱的相似度

指纹图谱的相似度代表指纹图谱的整体相关性，包括色谱指纹图谱的重叠率和共有峰强度信息。本实验采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（V2.0）。

3 结果

3.1 方法学考察结果

经中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析，精密度试验结果相似度≥0.976，RSD小于3%，表明仪器精密度良好。重现性试验结果相似度≥0.969，RSD小于3%，表明该样品方法重现性良好。稳定性试验结果相似度≥0.966，RSD小于3%，表明样品溶液48 h内有良好稳定性。

3.2 共有峰的标定

将不同品种人参样品的HPLC色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，进行色谱峰匹配，选择平均数法及时间窗宽度为0.10 s生成对照图谱，采用多点校正法建立人参指纹图谱，选择人参中的主要成分且分离较好的色谱峰作为共有峰，通过质谱共标定7个共有峰，见图1。

3.3 康美1号指纹图谱

在203 nm波长下，共检测到色谱峰83个，其中共有峰52个，共有率62.7%，整个色谱图基线较平整，平均相似度≥0.916，得到康美1号的指纹图谱，见图2。

3.4 福星1号指纹图谱

在203 nm波长下，共检测到色谱峰63个，其中共有峰38个，共有率60.3%，整个色谱图基线较平整，平均相似度≥0.938，得到福星1号的指纹图谱，见图3。

图1人参对照图谱（标定共有峰分别是人参皂苷Re、Rg1、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rd）Fig.1 Reference fingerprint of ginseng(The common peaks are ginsenoside Re，Rg1，Ro，Rb1，Rc，Rb2，Rd)

图2 10批次康美1号人参HPLC色谱图Fig.2 HPLC fingerprint of 10 batches of Kangmei No.1

图3 10批次福星1号人参HPLC色谱图Fig.3 HPLC fingerprint of 10 batches of Fuxing No.1

3.6 不同品种人参HPLC色谱分析

我们比较了康美1号、福星1号两个不同人参品种HPLC对照谱图，见图4，发现两个品种谱图总体相近，但也有些差别，这种差异主要体现在检出色谱峰和共有峰数量上的不同；康美1号与福星1号品种间相似度是0.875。结果表明不同品种人参在化学组成上有所不同，可为不同品种人参的质量评价和利用提供依据。

图4两品种人参HPLC对照谱图（S1为康美1号，S2为福星1号）Fig.4 Reference fingerprints of two varieties of ginseng(S1 is Kangmei No.1，S2 is Fuxing No.1)

4 结论

本研究利用中药色谱指纹图谱技术建立了两种不同人参品种的化学指纹图谱。利用高效液相色谱技术对两种人参各10批次进行了化学成分分析，建立了不同品种人参化学指纹图谱，各共有峰特征性明显。实验结果显示两品种化学组成相近，品种内植株间平均相似度在0.916以上；两个品种谱图总体类似，但也有些差别，这种差异主要体现在检出色谱峰和共有峰数量上的不同。康美1号与福星1号品种间相似度是0.875。实验表明中药色谱指纹图谱能够提供人参化学成分信息，为人参的品种分类鉴别和质量控制提供参考依据。