光果甘草愈伤组织总黄酮和总酚提取工艺优化

苗永美， 方 达， 王宇豪， 汪 雁， 张 维

(安徽科技学院 生命与健康科学学院，安徽 凤阳 233100)

光果甘草(

Glycyrrhiza

glabra

L.)是《中国药典》收录的3种药用甘草之一,又称为欧甘草,零星分布于我国新疆地区。光果甘草根中含黄酮(异黄酮)、总酚、皂苷、多糖等有效活性成分,具消炎、治肝硬化,降血脂和降血压、抗氧化等功效。近年来因光果甘草中的甘草定具有美白作用被誉称为“美白黄金”。

黄酮类和酚类化合物广泛存于植物体内,提取方法研究较多。其中黄酮提取方法主要有加热回流、超声辅助、微波辅助、双水相、闪式、超临界CO和微生物混合发酵等提取;多酚化合物提取方法有加热回流、酶解辅助、超声波辅助、微波辅助等。提取选用的溶剂有主要甲醇和乙醇。提取方法选择除了考虑方法本身特点外,还要考虑材料本身。愈伤组织用途广,可用于细胞培养生产次生代谢产物,还可作为诱变、转基因的受体,本研究选愈伤组织为材料,乙醇为溶剂,磁力搅拌加热冷凝回流提取法,单因素考察了4个主要因素,此基础上,再对温度、时间、液料比和乙醇浓度进行正交设计,优化出适合愈伤组织总黄酮和总酚的提取工艺,为后期光果甘草细胞培养中两种成分的检测提供方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料为实验室培养光果甘草茎段获取的愈伤组织。芦丁标准品(纯度>98%),没食子酸标准品(纯度>98%,上海伊卡生物技术有限公司);乙醇,Al(NO),NaNO,NaOH,NaCO,福林酚等均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 仪器

主要仪器包括DGG-9140B型电热恒温鼓风干燥箱(上海森信试验仪器有限公司);85-2型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司);ThermoHeraeus Multifuge X1R冷冻离心机,T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.3 方法优化

1.3.1 材料处理 洗净愈伤组织表面培养基,切成小块,60 ℃ 烘干,研磨,依次过40、60目筛,干燥保存备用。

1.3.2 单因素试验 分别对单因素试验涉及到的温度、时间、料液化和乙醇浓度分别进行考察。首先，0.40 g粉末按液料比60∶1加入 60%(V/V)乙醇,分别在40、50、60、70、80 ℃下冷凝回流提取25 min;其次，0.40 g粉末按液料比60∶1加入60%(V/V)乙醇,60 ℃条件下分别提取20、25、30、60、90、120 min;再次，0.40 g粉末,按液料比50∶1、60∶1、70∶1、80∶1分别加入60%乙醇,60 ℃提取25 min;最后，0.40 g粉末按液料比60∶1分别加入50%、60%、70%、80%乙醇,60 ℃提取25 min。所得提取液离心,上清用于总黄酮和总酚测定。试验重复3次。

1.3.3 正交设计试验 根据单因素结果,进行正交设计,选用4因素3水平表L(3)。总黄酮和总酚提取因素水平设计见表1～2,3组平行。

表1 总黄酮提取正交试验因素水平

表2 总酚提取正交试验因素水平

1.3.4 提取量计算 总黄酮含量以芦丁为标准品,采用亚硝酸钠-硝酸铝法测定,标准曲线方程A=7.428 6X-0.008 4(

R

=0.999 8),线性范围为0.025～0.15 mg/mL;总酚含量测定以没食子酸为标准品,采用福林酚法,标准曲线方程A=15.63X-0.010 3(

R

=0.998 7),线性范围为0.01～0.05 mg/mL。

2 结果与分析

2.1 单因素对2种活性成分含量的影响

温度、时间、液料比和乙醇浓度4个因素对总黄酮和总酚提取量的影响见图1。总黄酮提取量随温度升高呈先增大后降低趋势,60 ℃时最大,为3.35 mg/g;总酚提取量在提取温度50～70 ℃范围内急剧增加,80 ℃时最高,为11.42 mg/g。随提取时间延长,总黄酮的提取量先增大后降低,60 min时最大,为3.54 mg/g,但仅比30 min时提高了0.17%,从成本考虑,30 min为合适时间;总酚提取量在25 min时最高,仅比20 min的增加了0.46%,超过25 min后,提取率下降幅度大。液料比60∶1时,黄酮浸提量达到最大值,为3.34 mg/g;随着溶剂体系增加,总酚浸提效果越好,料液比70∶1时提取量达到11.59 mg/g。总黄酮和总酚提取量均随着乙醇浓度升高先急剧增加后缓慢降低,70%时提取率最高,分别为3.34、11.00 mg/g,高浓度乙醇可能是由于脂溶性杂质的溶解,改变了溶液性质从而降低了总黄酮、总酚提取率。

图1 单因素试验结果

2.2 正交试验对成份的影响

2.2.1 总黄酮提取 正交试验结果见表3,其方差分析及多重比较分别见表4～5。方差分析表明温度、时间、乙醇浓度对总黄酮提取率影响显著,液料比影响不显著。由

R

值可知,对提取量的影响由大到小依次为乙醇浓度>时间>温度>液料比。根据多重比较分析结果并考虑其成本,光果甘草愈伤组织总黄酮提取优化工艺为液料比50∶1、乙醇浓度60%、温度50 ℃、时间60 min。

表3 总黄酮L9(34)正交试验结果

表4 方差分析

表5 多重比较

2.2.2 总酚提取 正交试验结果见表6,方差分析及多重比较分别见表7～8。方差分析表明只有提取时间和乙醇浓度对总酚提取量影响显著。由R值可知,4个因素对总酚提取量的影响从大到小顺序为时间>乙醇浓度>温度>液料比。根据多重比较分析结果并考虑成本,光果甘草愈伤组织总酚提取优化工艺为液料比70∶1、乙醇浓度60%、温度70 ℃、时间25 min。

表6 总酚L9(34)正交试验结果

表7 方差分析

表8 多重比较

3 结论与讨论

植物药用成分的种类和含量因植物和生长年限而异,不同的提取方法和提取条件会得到不同的提取效果,因此选择提取方法时除了考虑方法本身特点外,还要考虑植物种类、年限、培养环境等。药用植物愈伤组织或细胞培养是生产代谢产物的重要途径,成分含量与培养条件、细胞株有关,目前有关光果甘草愈伤组织或细胞中黄酮或酚提取工艺优化研究较少,探究提取工艺的优化可最大程度地获取较高提取率,可为更好地筛选高产细胞株或培养条件优化提供检测方法。根据相溶相似原理,黄酮类和酚酸类物质常用甲醇和乙醇作溶剂,加热冷凝回流法或者借助超声、微波等辅助法最常用,李娜等选用甲醇作溶剂超声提取了2年生光果甘草四种器官中总黄酮。虽超声和微波能提高效率,但会对物质结构有一定破坏;甲醇使用安全性不如乙醇高;而光果甘草中总酚提取未见报道,因此本研究选用乙醇为溶剂,磁力加热搅拌冷凝回流提取总黄酮和总酚酸。方差分析表明温度、时间、乙醇浓度对总黄酮提取率影响显著,而液料比对提取率影响不显著,50∶1～70∶1范围内均可;时间和乙醇浓度对总酚的提取量影响显著,而温度和液料比对提取率影响不显著,70～90 ℃,70∶1～90∶1范围内均可。不同植物所含黄酮和酚类型不同,结构的不同决定着极性不同,因此,不同植物体内的黄酮和酚提取需要不同极性的溶剂。本研究表明低浓度乙醇不利于黄酮和酚的浸出,而高浓度乙醇可能因为使更多的非目标物质浸出干扰了检测,或者由于溶质溶剂极性差异影响了浸出。目标成分的浸出需要合适温度和时间,过高的温度和长时间浸提会引起聚合或分解,从而影响了产量。

综上所述，根据各个因素不同水平影响差异,得到总黄酮提取优化工艺为液料比50∶1、乙醇浓度60%、温度50 ℃、时间60 min;总酚提取工艺为液料比70∶1、乙醇浓度60%、温度70 ℃、时间25 min。由此看出,光果甘草中总黄酮的提取需要较小溶剂量、较低温、长时间,而总酚的提取需要较大溶剂量、较高温、短时间。