p16/Ki-67细胞双染对HR-HPV阳性的宫颈高级别鳞状上皮内病变的预测价值*

东 蓓，周素芳，张 璇

苏州高新区人民医院妇产科，江苏苏州 215129

宫颈癌在发展中国家病死率较高，及时诊治宫颈高级别鳞状上皮内病变(HSIL)在一定程度可预防该病[1-3]。宫颈鳞状上皮内病变(SIL)与高危型人乳头状瘤病毒(HR-HPV)感染密切相关[4-8]。

目前，临床初筛SIL主要采取宫颈液基细胞薄层技术(TCT)和HR-HPV检测，但均存在不足[9]。TCT特异度高，灵敏度低，缺乏统一的质控标准。HR-HPV检测灵敏度高，特异度低，不能预判宫颈病变及程度。p16/Ki67相对表达水平与宫颈病变级别具有直接相关性，p16/Ki-67细胞双染特异度高,灵敏度与HR-HPV近似，具有良好的应用前景。本研究对HR-HPV阳性者进行p16/Ki-67细胞双染、TCT检测及阴道镜下宫颈活检，探讨p16/Ki-67细胞双染对HSIL的预测价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年7月至2019年7月在本院门诊接受宫颈癌筛查HR-HPV检测阳性患者为研究对象。纳入标准：(1)HR-HPV阳性；(2)患者同意该研究并签署知情同意书。排除标准：(1)既往接受过SIL或宫颈癌治疗；(2)合并其他恶性肿瘤；(3)合并妊娠；(4)患者拒绝签署知情同意书。该研究已获得本院伦理委员会批准(编号：[2016]第013号)。

1.2方法

1.2.1实验方案 根据纳入、排除标准，受试者均进行p16/Ki-67细胞双染、TCT及阴道镜下宫颈活检。

1.2.2HR-HPV检测 宫颈脱落细胞用多功能SLAN-96 S医用PCR系统(上海宏石公司)进行HR-HPV DNA检测，包括13种HR-HPV型别，分别为HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68型。根据试剂说明进行检测，HR-HPV任一型别阳性即诊断为HR-HPV阳性。

1.2.3p16/Ki-67细胞双染检测 收集的宫颈脱落细胞保存至盛有新柏氏的瓶中，采用ThinPrep 2000系统(美国Hologic公司)进行处理。采用p16/Ki-67检测试剂盒(亚能生物公司)，根据试剂说明进行染色并判读结果。研究结果由专业检验技师进行观察、分析，并将显微镜下的观察画面以图片方式进行保存和记录。p16/Ki-67细胞双染将p16阳性定义为胞质棕染和(或)胞核棕染，Ki-67阳性定义为胞核红染。如在同一细胞中同时出现胞质棕染和胞核红染，无论染色深度高低和表达水平强弱，均视为p16/Ki-67阳性[10-11]。

1.2.4TCT检测 TCT采用ThinPrep 2000制片机(北京豪洛捷公司)进行检测，结果以Bethesda系统为依据，分为无上皮内病变或恶性病变(NILM)、意义不明的不典型鳞状细胞(ASCUS)、非典型鳞状细胞、不除外高级别鳞状上皮内病变、不典型腺细胞、低级别鳞状上皮内病变(LSIL)、HSIL、鳞癌、原位腺癌和腺癌。本研究将TCT判读结果ASCUS以下者定义为TCT结果阴性，ASCUS及以上者为阳性。

1.2.5阴道镜下宫颈活检 受试者在p16/Ki-67细胞双染、TCT采样后1个月内，由高级职称同一医生进行阴道镜检查。3%醋酸和1%复方碘液涂抹宫颈，可疑病灶取活检，如无明显可疑病灶，取3、6、9、12点活检，转化区暴露不满意者行宫颈管搔刮术。病理结果也由2名高级职称病理医生进行判读。结果分为：慢性炎或见挖空细胞、LSIL(CIN 1)、HSIL(CIN2～3)及以上。

2 结 果

2.1一般情况 共有297例具有完整资料的患者纳入本研究，年龄29～67岁，平均(48.87±7.68)岁。组织病理学结果显示，慢性炎或见挖空细胞占总例数的56.90%(169/297)；LSIL患者占26.26%(78/297)；HSIL及以上者占16.84%(50/297)，其中鳞癌2例。p16/Ki-67细胞双染总阳性率为32.66%(97/297)。TCT提示ASCUS及以上者占21.55%(64/297)。见表1。

2.2不同病理结果中p16/Ki-67的阳性率 慢性炎或见挖空细胞中p16/Ki-67的阳性率为9.47%(16/169)；LSIL阳性率为41.03%(32/78)；HSIL及以上阳性率为94.00%(47/50)，其中鳞癌阳性率为100.00%(2/2)。组织病理学结果HSIL及以上：p16/Ki-67双染的灵敏度为98.00%，特异度为80.56%，阳性似然比为5.16，阴性似然比为0.02。根据p16/Ki-67细胞双染检测结果绘制ROC曲线，p16/Ki-67细胞双染的ROC曲线下面积为0.905(95%CI：0.872～0.978)。见表1。

2.3不同病理结果中TCT的阳性率 本研究中，TCT结果ASCUS及以上者为11.78%(35/297)。组织病理学诊断结果HSIL及以上：TCT的灵敏度为70.00%，特异度为88.23%，阳性似然比为5.80，阴性似然比为0.34。绘制ROC曲线，TCT的曲线下面积为0.850(95%CI：0.772～0.928)。

2.4p16/Ki-67细胞双染与TCT比较 p16/Ki-67细胞双染的灵敏度和特异度均较高，且灵敏度高于TCT。p16/Ki-67细胞双染曲线下面积较TCT大(0.905>0.850)，p16/Ki-67细胞双染与TCT在HSIL的检测阳性率进行比较，差异有统计学意义(χ2=14.583，P<0.001)。见表1。

表1 p16/Ki-67细胞双染和TCT在不同组织病理学结果中的表达(n)

续表1 p16/Ki-67细胞双染和TCT在不同组织病理学结果中的表达(n)

3 讨 论

研究发现，超过99%的宫颈癌是由HR-HPV持续感染所致[12]。生物学标志物在当今临床研究中扮演着越来越重要的作用，p16的半衰期较短，具有细胞周期素依赖性，在细胞周期中发挥重要的抑癌作用。相关研究显示，在宫颈癌形成过程中，E7作为HPV的癌蛋白，也是确立和维持恶性表型的必要因素，由于E7介导的PRb功能性失活，导致p16水平过度表达[13]。因此，p16被认为是HPV感染的替代性标志物，与HR-HPV的致癌活性具有直接相关性。

Ki-67是一种核内蛋白，与细胞分裂增殖具有直接相关性，其相对表达水平可在一定程度上反映细胞增殖活跃程度。研究表明，在Ki-67表达于G0期以外的所有细胞周期中，过度表达p16的细胞只有在细胞周期调控机制受损后才会活跃增殖，在正常生理条件下，同一细胞内不能同时表达Ki-67和p16[14]。因此，细胞内同时表达Ki-67和p16可作为细胞周期调控失常的标志，当双染阳性出现时，则意味着可能出现HSIL。由于 p16/Ki-67细胞双染的理论基础在于抗体与抗原的特异性结合,具有可重复性和客观性，不易被主观因素所影响，因此，有助于取得更加客观的诊断结果[15]。

本研究中，p16/Ki-67细胞双染阳性率随着病理结果异常度的升高而升高，这与其他相关研究结论一致[16-17]。p16/Ki-67细胞双染和TCT的ROC曲线下面积分别为0.905(95%CI：0.872～0.978)及0.850(95%CI：0.772～0.928)。p16/Ki-67细胞双染的曲线下面积较TCT大(0.905>0.850)。研究结果显示，针对HSIL检测而言，p16/Ki-67细胞双染HSIL检测阳性率优于TCT。两者进行χ2检验，结果显示，p16/Ki-67双染与TCT比较，差异有统计学意义(χ2=14.583，P<0.001)。这一结果与廖光东等[18]对62例HR-HPV阳性妇女进行p16/Ki-67细胞双染预测宫颈病变的报道相一致。

本研究中病理结果HSIL及以上者TCT的灵敏度为70.00%，特异度为88.23%，与相关研究提示TCT客观性较差，假阴性率、假阳性率为5%～50%的结果并不一致[19]。究其原因，可能与本次试验样本量较小及TCT检查结果判读的主观因素有关。

此外，研究发现，p16/Ki-67细胞双染及TCT阳性似然比分别为5.16、5.80，阴性似然分别比0.02、0.34。研究结果提示，p16/Ki-67细胞双染对HISL的阴性预测价值优于TCT。该结果与吴忧等[20]对251例细胞学诊断为ASCUS及以上的患者进行p16/Ki-67细胞双染的结论一致。

临床上对HSIL初筛主要采取TCT和HR-HPV检测，2种技术在诊断灵敏度和特异度方面均存在一定的不足。而本研究采用的p16/Ki-67细胞双染诊断HSIL具有较高的灵敏度和特异度。因此，在临床实践中，可以考虑选取HR-HPV联合p16/Ki-67细胞双染进行宫颈癌初筛，以尽可能减少漏诊及诊治过度。