血浆SEPT9基因甲基化在结直肠癌根治术后复发监测中的应用

赵雅霞

陆军军医大学第一附属医院检验科，重庆 400038

结直肠癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤，随着我国老龄化的加剧和饮食结构的变化，其发病率逐年增加，在全部恶性肿瘤中排第3位[1-4]。 结直肠癌患者早期症状不显著，但随着肿瘤组织的不断生长，会逐渐压迫周边器官组织，导致腹泻、便秘、排便习惯改变、便血和腹痛等，随着病情的逐渐加重，患者还有可能出现肠腔狭窄、梗阻、贫血和恶病质等症状，严重威胁患者身体健康[5-6]。目前临床多采用以早期手术为主的综合治疗方案，早期诊断尤为重要。常用的诊断方法有粪便免疫化学试验(FIT)、癌胚抗原(CEA)检测和粪便隐血试验(FOBT)[7-9]。FIT和FOBT价格低，操作方便，但是容易受到其他肠道疾病的影响，因此，特异度比较低；CEA作为大肠癌蛋白标志物，灵敏度和特异度均较低。近期国内外研究发现，血浆SEPT9基因甲基化(mSEPT9)在结直肠癌早期诊断中有较高的灵敏度和特异度，有望成为结直肠癌诊断的早期指标[10-12]。为明确血浆mSEPT9检测在结直肠癌患者术后复发监测中的效果，本研究通过回顾性分析，对血浆mSEPT9检测在结直肠癌患者术后复发监测中的应用价值进行探讨，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2014年4月至2018年4月在本院行结直肠癌根治术的154例结直肠癌患者作为研究对象。其中男79例，女75例；年龄38～80岁，平均(62.39±11.26)岁；TNM Ⅰ期18例，Ⅱ期82例，Ⅲ期54例。纳入标准：(1)于本院就诊且首次经过结肠镜或病理活检确诊为结直肠癌的患者，未进行相关的治疗；(2)于本院接受规范化结直肠癌手术治疗；(3)所有病例资料完整，包括病理、病史和实验室检测相关指标。排除标准：(1)伴有其他恶性肿瘤；(2)伴风湿性关节炎、肾病综合征等免疫系统疾病。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2方法 应用回顾性分析法对所有研究对象的年龄、性别和TNM分期等一般资料进行分析，并在患者行根治术后进行为期2年的跟踪调查。

1.2.1血浆mSEPT9检测 利用Epipro Colon Plasma Quick试剂盒对所有患者经处理后的外周血标本进行游离DNA提取，经裂解、洗涤、洗脱后获得100 μL游离DNA，洗脱液加入150 μL亚硫酸盐溶液和25 μL保护液在80 ℃恒温箱中保存45 min，与磁珠结合后3次洗涤磁珠，室温干燥后加入60 μL洗脱液，在23 ℃下洗脱亚硫酸盐转化的DNA。应用Epi proColon2.0试剂盒在美国Applied Biosystems公司生产的ABI7500 PCR仪上进行血浆mSEPT9 V2区检测，在15 μL PCR预反应液中加入15 μL经亚硫酸盐转化的DNA标本，行三重平行PCR测试。测试结果根据试剂盒说明书进行判定，当三重平行PCR测试中两重及以上的mSEPT9循环阈值(Ct值)<45时，表示判定结果为阳性[13-14]。

1.2.2血清CEA检测 应用德国Roche公司生产的CEA检测试剂盒在同公司生产的Elecsys 2010分析仪上进行CEA检测，结果根据试剂盒说明书进行评定，当CEA≥5 ng/mL时，表示判定结果为阳性。

1.3评定标准 以全部154例患者术前的年龄、性别、体质量指数(BMI)、淋巴结转移、发生部位、血管是否侵犯、脉管是否侵犯、TNM分期、术后复发等一般资料及病理特征作为标准，分析患者血浆mSEPT9检测结果同上述一般资料及病理特征数据间的关系。所有患者术前和术后均行血浆mSEPT9检测，且患者术后2年随访期间均每隔3个月进行1次复查，并对患者的血浆mSEPT9和血清CEA进行检测。

2 结 果

2.1结直肠癌患者术前一般资料及病理特征同血浆mSEPT9检测结果间的关系 154例患者术前血浆mSEPT9检测阳性率为70.13%(108/154)，其中TNM Ⅰ期阳性率为44.44%(8/18)，Ⅱ期阳性率为63.41%(52/82)，Ⅲ期阳性率为88.89%(48/54)。随着患者TNM分期的提高，血浆mSEPT9检测阳性率也随之升高，且Ⅰ、Ⅱ期患者阳性率均低于Ⅲ期(P<0.05)。淋巴结转移患者血浆mSEPT9检测阳性率为95.89%，明显高于淋巴结未转移患者(46.91%)，差异有统计学意义(P<0.05)，但患者术前血浆mSEPT9检测阳性率在不同年龄、性别、BMI、发生部位、血管是否侵犯、脉管是否侵犯间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 结直肠癌患者术前一般资料及病理特征同血浆mSEPT9检测结果间的关系[n(%)]

续表1 结直肠癌患者术前一般资料及病理特征同血浆mSEPT9检测结果间的关系[n(%)]

2.2结直肠癌患者手术前后血浆mSEPT9检测结果比较 154例患者术后血浆mSEPT9检测阳性率为7.79%(12/154)，与术前[70.13%(108/154)]比较，差异有统计学意义(χ2=123.213 7，P<0.001)。

2.3结直肠癌患者术后复发情况及血浆mSEPT9检测和血清CEA检测差异比较 经过2年的随访发现，154例患者中有46例(29.87%)复发，复发患者的血清CEA检测阳性率为41.30%(19/46)，血浆mSEPT9检测阳性率为80.43%(37/46)，复发患者的血浆mSEPT9检测阳性率要高于血清CEA检测(χ2=13.188 5，P=0.000 3)。

3 讨 论

结直肠癌是临床上较常见的消化系统恶性肿瘤疾病，病因尚不明确，但一般认为同疾病因素、遗传因素和不良饮食习惯等密切相关。吴东等[7]研究发现，结直肠癌在我国恶性肿瘤疾病中发病率和病死率居第3～5位，具有病死率高和预后差等特点。有研究发现，我国每天结直肠癌患者新发例数超过25万，死亡例数约为14万，新发和死亡例数占全世界同期病例的20%左右[15-17]。临床研究发现，结直肠癌患者死亡率在各类消化系统恶性肿瘤疾病中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。从世界范围来说，我国的结直肠癌发生率较低，但近几年随着饮食习惯的改变和生活压力的增加，我国结直肠癌发病率呈增加趋势[18-20]。蔡克银等[21]研究发现，由于我国人们生活方式和饮食习惯的改变，结直肠癌已成为我国增长速度最快的恶性肿瘤之一。徐峰等[22]的研究也发现，近年来，我国结直肠癌发生率和病死率呈上升趋势，严重威胁人们的身体健康。目前，临床上外科根治术仍是结直肠癌患者的首选治疗手段，有助于患者生命的延长。有研究发现，结直肠癌患者根治术后复发率在30%～50%，是导致患者术后死亡的主要原因之一[23-25]。因此，对结直肠癌患者的术后复发风险进行评估，对预防患者疾病复发，延长患者生命有重要意义。堵一乔等[26]研究发现，结直肠癌作为严重威胁人类健康的消化道肿瘤疾病，CEA、粪便隐血试验和结肠镜检等诊断方式虽较常见，但存在灵敏度低和特异度不高等缺陷，无法准确判断患者有无转移或复发。研究发现，结肠镜检虽然是结直肠癌诊断的“金标准”，但因其有创伤性易导致患者出现肠道穿孔等不良反应，临床应用受到限制[27]。因此，寻求更加精确有效的结直肠癌复发风险监测方式十分重要。

SEPT9位于染色体17q25.3上，在细胞分裂末期有重要作用，参与肿瘤新生血管生成和细胞增殖。目前在多种恶性肿瘤如宫颈癌、乳腺癌和头颈部鳞状细胞癌中发现SEPT9基因处于过表达状态，具有促癌作用[28-30]。近几年，随着医学诊断技术的不断进步，大量研究发现外周血mSEPT9检测技术在结直肠癌筛查中具有较高的灵敏度和特异度。丁清清等[31]研究发现，mSEPT9监测具有极高的灵敏度和特异度，有助于人群肠癌筛查依从性的提升。张立营等[32]的研究发现，SEPT9基因的5′调控序列中存在CpG岛，结直肠癌患者患病过程中约有90%的患者SEPT9基因中的该序列发生甲基化。金鹏[33]的研究也发现，SEPT9基因的表达调控机制非常复杂，虽未完全明确但SEPT9基因的过甲基化仍可作为早期结直肠癌检测的分子标志物。本研究结果发现，结直肠癌患者术前血浆mSEPT9检测阳性率在不同年龄和性别间差异无统计学意义(P>0.05)，但与患者的TNM分期情况有着直接的关系，患者分期等级越高血浆mSEPT9检测阳性率越高；且结直肠癌患者手术前后的血浆mSEPT9检测阳性率差异有统计学意义(P<0.05)，淋巴结转移患者血浆mSEPT9检测阳性率为95.89%，明显高于淋巴结未转移患者(46.91%)，差异有统计学意义(P<0.05)，但是患者术前血浆mSEPT9检测阳性率在不同年龄、性别、BMI、发生部位、血管是否侵犯、脉管是否侵犯间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，说明血浆mSEPT9检测结果可以作为评价结直肠癌手术疗效的标准。贺娜等[11]的研究表明，结直肠癌患者血浆mSEPT9检测阳性率明显升高，与本研究一致。因有研究证明结直肠癌患者术后血清CEA水平的升高是患者复发转移的风险因素[34]，本文对比了术后复发患者的血清CEA结果与血浆mSEPT9结果，发现血浆mSEPT9检测阳性率要高于血清CEA检测阳性率(P<0.05)，说明血浆mSEPT9检测结果可以作为结直肠癌患者术后复发检测的分子标志物。赵慧霞等[35]和郁迪等[36]研究均发现，mSEPT9能够作为结直肠癌特异的分子标志物。也有研究表明，mSEPT9具有良好的大肠癌检出性能，可用于大肠癌筛查[37-38]。且mSEPT9检测方便，重复性高，为结直肠癌的早期诊断干预提供了有力证据。当然，杨宏宇等[39]研究也表明，mSEPT9在结直肠癌检测中存在一定的不足，检测结果易受多种因素的影响。因此，临床检测过程中应注意检测环境的质量控制，尽量避免外界因素影响检测结果。由于本研究为回顾性研究，且属于单中心研究，纳入样本量有限，下一步将展开大样本多中心的临床研究，进一步观察mSEPT9检测在结直肠癌早期诊断及预后中的价值。

综上所述，血浆mSEPT9不仅可以作为检测结直肠癌患者手术疗效的标准，还可以作为结直肠癌患者术后复发检测的分子标志物。