习惯性流产患者血清ENO1Ab、ACA、Tim-1的水平及意义

李绍武，李志霞，肖 华，卓 芬，黄娟娟

海南省第三人民医院检验科，海南三亚 572000

习惯性流产(RSA)是临床常见的早期妊娠并发症，以下腹疼痛、阴道出血为常见临床症状，严重威胁女性患者身心健康[1-2]。目前，RSA发病机制虽尚未完全明确，但研究者认为其发病与环境、内分泌失调、遗传缺陷、炎性反应、免疫功能异常等相关[3-4]。相关文献报道，抗α-烯醇化酶(ENO1)抗体(ENO1Ab)在不明原因的RSA患者血清中水平升高，可能是不明原因RSA的自身免疫生物标志物[5]。另有研究显示，抗心磷脂抗体(ACA)在RSA患者血清中呈高水平，经黄体酮联合孕康口服液治疗后，其水平降低，因此，ACA可能参与并影响RSA的发病过程[6]。此外，T细胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白-1(Tim-1)在RSA患者血清中水平升高，经淋巴细胞免疫疗法成功治疗后，其水平下降，Tim-1可能与RSA的病理进展有关[7]。本研究通过检测ENO1Ab、ACA、Tim-1在RSA患者血清中的水平，分析三者的临床意义，以期为临床早期诊治RSA提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年2月至2019年12月本院诊治的RSA患者124例为RSA组，患者年龄22～34岁，平均(28.08±2.29)岁；孕周4～12周，平均(8.76±2.54)周。选择同期本院129例体检健康的早孕女性为健康对照组，其中年龄23～35岁，平均(27.96±3.22)岁；孕周5～12周，平均(8.62±2.43)周。2组年龄、孕周比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。收集2组年龄、收缩压、舒张压、文化程度、职业、生殖道感染、孕期被动吸烟等一般资料。

RSA患者纳入标准：(1)患者妊娠孕周为4～12周；(2)有RSA史。健康对照组纳入标准：(1)既往未出现死胎、死产，无RSA史；(2)此次妊娠期间生命体征无任何异常；(3)经B超检查胚胎发育健康；(4)无病毒感染史、妇科疾病史。RSA组、健康对照组排除标准：(1)合并精神异常；(2)合并免疫系统疾病、内分泌系统疾病、心脑血管疾病、遗传性疾病；(3)合并严重心、肝、肾等重要器官功能障碍。所有孕妇自愿参与本研究，均签署知情同意书，且本研究所用方法符合伦理学要求，经本院伦理委员会批准后开展实施。

1.2仪器与试剂 Trizol Reagent(货号：J44580)购自上海金穗生物科技有限公司，Revert Aid First Strand cDNA Synthesis试剂盒(货号：69001-3)购自北京泰泽嘉业科技发展有限公司；SYBR Green master mix(货号：203401)购自上海浩洋生物科技有限公司。重组人 ENO1蛋白试剂盒(货号：11554-H07E-100)购自上海江莱生物科技有限公司，人ACA酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(货号：CSB-E04977h-1)购自上海恒斐生物科技有限公司，人白细胞介素(IL)-2 ELISA试剂盒(货号：QN-PS0055)购自上海乔羽生物科技有限公司，IL-4 ELISA试剂盒(货号：111010)购自广州蕊特生物科技有限公司。紫外分光光度计(型号：DU-730)购自上海普迪生物技术有限公司，ABI 7500Fast实时荧光定量PCR(qPCR)仪(型号：ABI 7500Fast )购自北京安麦格贸易有限公司，酶标仪(型号：AMR-100)购自杭州奥盛仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1标本收集 收集所有受试者清晨空腹外周血5～6 mL于真空采血管中，室温静置35 min，4 ℃以4 200 r/min离心8 min，留取上层血清，分装于无菌EP管中，保存于-80 ℃冰箱中，备用。

1.3.2qPCR检测血清Tim-1水平 于-80 ℃冰箱中取出适量冻存血清标本，解冻，以Trizol法提取标本总RNA，参照反转录Revert Aid First Strand cDNA Synthesis试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA。根据SYBR Green master mix扩增反应试剂盒说明书将PCR扩增、定量检测。反应体系总体积为20 μL：Premix 10 μL，cDNA 2.0 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.8 μL，ddH2O 4.0 μL，F/R各1.6 μL。反应条件设置：97 ℃预热8 min；95 ℃变性20 s，64 ℃退火25 s，40个循环。Tim-1以GAPDH为内参，Tim-1上游引物序列为5′-GAA CAT TAG TCT ACT GAC GGC CAA TAC-3′，下游引物序列为5′-GAA CCT CCT TTT TGA AGA AAT ACT TTT T-3′；GAPDH上游引物序列为5′-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3′，下游引物序列为5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3′。以2-ΔΔCT法计算Tim-1水平。

1.3.3ELISA检测血清ENO1Ab、ACA、IL-2、IL-4水平 按照血清ENO1Ab、ACA、IL-2、IL-4 ELISA试剂盒说明书配制不同水平的标准样品，利用酶标仪检测不同水平标准品在450 nm处的吸光度(A)值，绘制各指标的标准回归曲线。取适量冻存血清标本，解冻，检测标本在450 nm处的A值，根据标准回归曲线计算血清ENO1Ab、ACA、IL-2、IL-4水平。

2 结 果

2.12组一般资料比较 与健康对照组比较，RSA组患者生殖道感染、孕期被动吸烟比例升高，差异有统计学意义(P<0.05)。2组年龄、收缩压、舒张压、文化程度、职业比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组一般资料比较

2.22组血清ENO1Ab、ACA、Tim-1水平比较 与健康对照组比较，RSA组患者血清ENO1Ab、ACA、Tim-1水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组血清ENO1Ab、ACA、Tim-1水平比较

2.32组血清IL-2、IL-4水平比较 与健康对照组相比，RSA组患者血清IL-2水平明显升高，IL-4水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 2组血清IL-2、IL-4水平比较

2.4RSA患者血清ENO1Ab、ACA、Tim-1水平与IL-2、IL-4水平的关系 Pearson相关分析结果显示，RSA患者血清ENO1Ab、ACA、Tim-1水平与IL-2水平呈正相关(P<0.05)，与IL-4水平呈负相关(P<0.05)。见表4。

表4 RSA患者血清ENO1Ab、ACA、Tim-1水平与IL-2、IL-4水平的相关性

2.5RSA患者血清ENO1Ab、ACA、Tim-1水平间的关系 Pearson相关分析结果显示，RSA患者血清ENO1Ab、ACA水平与Tim-1水平呈正相关(r=0.467、0.465，P<0.05)，ENO1Ab水平与ACA水平无明显相关性(r=0.119，P>0.05)。见图1。

注：A表示 RSA患者血清ENO1Ab水平与Tim-1水平的关系；B表示RSA患者血清ACA水平与Tim-1水平的关系；C表示RSA患者血清ENO1Ab水平与ACA水平的关系。

2.6RSA发生的影响因素分析 以是否发生RSA为因变量，以生殖道感染、孕期被动吸烟、ENO1Ab、ACA、Tim-1、IL-2、IL-4水平为自变量，进行Logistic回归分析，结果显示，生殖道感染、高ENO1Ab、ACA、Tim-1、IL-2水平是影响RSA的危险因素(P<0.05)，高IL-4水平是影响RSA的保护因素(P<0.05)。见表5。

表5 RSA发生的Logistic回归分析结果

3 讨 论

ENO1是一种糖酵解酶，其可调控能量代谢，与免疫类疾病关系密切[8]。有关研究显示，ENO1可作为自身抗原诱导自身免疫反应，可增加自身免疫甲状腺炎女性发生流产的风险[9]。另有研究表明，自身免疫甲状腺炎患者血清ENO1Ab水平明显增加，ENO1Ab可能在自身免疫甲状腺炎免疫反应过程中起重要作用[10]。以上研究表明，ENO1或ENO1Ab水平异常可能与免疫功能异常类疾病有关。本研究中RSA组患者血清ENO1Ab水平明显高于健康对照组，与以往研究一致[3]，提示ENO1Ab可能在RSA疾病进程中起重要作用，推测ENO1Ab通过影响免疫反应，进而影响RSA的发生、发展。

ACA是一组自身抗体，其可增加血栓素水平，影响前列腺素生成，引起母体及胎盘发生血管痉挛和供血不足，促进血栓形成；同时，ACA可与胎盘血管相应受体结合，引起蜕膜血管变化，从而导致胎盘栓塞。另外，ACA可刺激血小板聚集，血栓形成加剧，促使胎盘病变加重，进而引起胎盘或胎儿缺血缺氧，从而导致流产[11]。ACA在原因不明ACA患者中水平较高，经中西医结合治疗后，其水平降低，ACA可能在不明原因RSA中发挥重要作用。本研究中RSA组患者血清ACA水平明显升高，其可能参与并影响RSA病理发展过程。究其原因，ACA可能通过影响胎盘血氧供应等进而在RSA中发挥一定作用。

Tim-1是Tim家族重要成员之一，可与其配体发生特异性结合，进而调控T淋巴细胞增殖、分化，促进细胞因子分泌，激发Th2型免疫应答，进而影响Th1/Th2平衡，与自身免疫病的免疫应答关系密切[12]。相关研究资料显示，Tim-1在系统性红斑狼疮患者血清中高表达，经人免疫球蛋白和醋酸泼尼松联合治疗后，其水平明显下降，Tim-1可能在系统性红斑狼疮疾病发展中有重要作用[13]。另有研究显示，Tim-1在原发性胆汁性肝硬化中表达上调，其可作为诊治原发性胆汁性肝硬化的潜在靶标[14]。以上研究证明，异常表达的Tim-1可能影响免疫类疾病发病进程。本研究中Tim-1在RSA组患者血清中水平升高，与以往研究一致[5]，提示Tim-1可能在RSA的发生、发展中起一定作用，推测Tim-1通过影响炎性因子释放及Th2型免疫应答，进而影响RSA的病理发展。

既往研究显示，T淋巴细胞亚群比例失衡是影响流产的重要因素[15]。Th1/Th2细胞因子变化与RSA密切相关，机体Th2型细胞因子较多时有助于维持健康妊娠，但机体Th1型细胞因子较多时可能引发流产[16]。有关研究显示，IL-2、IL-4分别是由Th1、Th2型细胞分泌的主要细胞因子，RSA患者血清中IL-2水平升高，IL-4水平降低，IL-2、IL-4可能在RSA的免疫反应中起重要作用[17]。本研究中RSA组患者血清IL-2水平明显高于健康对照组，IL-4水平明显低于健康对照组，与刘文亚等[17]研究一致，提示IL-2、IL-4可能通过影响机体免疫反应过程，进而参与RSA的发病进程。本研究显示，RSA患者血清ENO1Ab、ACA、Tim-1水平与IL-2水平呈正相关，与IL-4水平呈负相关，提示ENO1Ab、ACA、Tim-1可能与IL-2、IL-4相互作用，进而共同影响RSA的发展过程。进一步研究显示，RSA患者血清ENO1Ab、ACA水平与Tim-1水平呈正相关，提示ENO1Ab、ACA可能与Tim-1相互作用，从而共同影响RSA的发展，但具体影响机制仍需深入研究。研究发现，生殖道感染、高ENO1Ab、ACA、Tim-1、IL-2水平是影响RSA的危险因素，高IL-4水平是影响RSA的保护因素，及时监控血清ENO1Ab、ACA、Tim-1、IL-2、IL-4水平及生殖道感染状况，有助于早期诊治RSA。但本研究样本较少，可能会导致结果出现一定偏差，后续试验将扩大样本量进行深入研究。