多重不对称PCR-电化学芯片技术检测感染性腹泻病原体的临床价值*

程 强，周 磊，付晓蕊，徐修礼，刘家云，郝晓柯

空军军医大学西京医院检验科，陕西西安 710032

腹泻是指每日排便3次或3次以上，且粪便性状异常，如稀便、水样便、黏液便、脓血便或血便等[1]。感染性腹泻是指由病原微生物及其产物或寄生虫所引起的、以腹泻为主要临床特征的一组肠道传染病[2]。感染性腹泻居我国法定传染病发病率首位，具有病原体种类复杂、混合发病率高、发病聚集性等特征，是重要的公共卫生事件之一。在暴发流行时，对感染性腹泻病原体进行快速诊断，对疫情的防控具有重要意义[3]。本研究以多重不对称PCR-电化学芯片技术(简称电化学芯片法)检测感染性腹泻相关病原体，与FilmArray gastrointestinal panel法(简称FilmArray法)、普通细菌培养和病毒测序方法比较，计算检测结果的阳性检出率和一致性，探讨电化学芯片法的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2018年10月至2019年6月本院儿科住院及门诊病例标本，患儿以呕吐或腹泻等消化道症状为主诉，24 h内腹泻大便次数≥3次，粪便性状异常的腹泻患儿新鲜粪便标本。本研究采取患儿自愿原则，获得患儿及家属的知情同意。

1.2仪器与试剂 DA910电化学基因传感器检测系统、Smart 32全自动核酸提取仪购自中山大学达安基因股份有限公司；FilmArray全自动PCR分析系统购自法国生物梅里埃股份有限公司。核酸提取或纯化试剂(磁珠法)、腹泻病原体检测试剂盒(电化学芯片法)购自中山大学达安基因股份有限公司；FilmArray gastrointestinal panel购自法国生物梅里埃公司。选择性培养基(SS平板)；显色培养基(弧菌显色培养基、大肠显色培养基)。沙门菌诊断用血清；副溶血弧菌诊断用血清。所有试剂均在有效期内使用。

1.3方法 取就诊时腹泻患儿新鲜粪便标本，立即放入Copan转运培养基中送检。以普通细菌培养和病毒测序结果作为诊断的“金标准”。普通细菌培养：取新鲜待测标本立即接种于大肠显色培养基、弧菌显色培养基、沙门菌显色培养基、TCBS平板、XLD平板、SS平板培养基上，37 ℃培养箱孵育16～24 h，同时接种3%氯化钠碱性蛋白胨水、改良亚硒酸盐磺绿增菌肉汤增菌培养后，挑取可疑菌落转种至三糖铁琼脂等培养基，进一步进行肠道致病菌生化试验、血清型分型试验和药敏试验。结果依据每年美国临床实验室标准化协会(CLSI)M100-S23标准进行判读。病毒测序：待测标本采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序。电化学芯片法：使用Smart 32全自动核酸提取仪或纯化试剂(磁珠法)进行待测标本的核酸提取、纯化、扩增、杂交等，之后使用腹泻病原体检测试剂盒，针对17种常见的腹泻相关病原体设计特异性引物和探针，探针包括捕获探针和信号探针。捕获探针分别固定在特制的印刷电路板金电极表面，制备成腹泻电化学传感器(芯片)，用于捕获PCR多重扩增产物；信号探针与已捕获的PCR产物特异结合。由于信号探针标记有二茂铁分子，通过夹心杂交产生电流的变化，应用电化学基因传感器检测系统检测出电流值(信号值)，最后对17种病原体检测信息进行判定。试剂盒中的阴性质控品参与提取，用于对环境进行监控； C-FX 阳性质控品参与提取，用于 PCR 检测试剂的质控。FilmArray法：将待测标本根据规定条件加样，使用FilmArray gastrointestinal panel和分析系统检测。标准菌株：致泻性大肠埃希菌、肠炎沙门菌、副溶血性弧菌、福氏志贺菌等均来自于本实验室保存。

1.4统计学处理 使用SPSS20.0统计软件进行数据处理，计数资料以率表示，电化学芯片法、FilmArray法与“金标准”方法结果比较，采用χ2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。电化学芯片法、FilmArray法与“金标准”方法结果的一致性使用Kappa一致性检验进行分析，Kappa>0.4表示具有一致性。

2 结 果

2.1研究对象人群特征及不同方法病原检出情况 随机选取102例感染性腹泻患儿，年龄1～15岁，男性54例，女性48例，以普通细菌培养和病毒测序结果作为“金标准”，使用3种不同方法对102例腹泻标本进行肠道病原体检测，结果见表1。“金标准”方法共82例标本呈阳性，阳性检出率为80.39%，共检出病毒102株，细菌18株。电化学芯片法检测出78例标本呈阳性，阳性检出率为76.47%，共检出病毒81株，细菌15株。FilmArray法检测出86例标本呈阳性，阳性检出率为84.31%，共检出病毒111株，细菌32株。3种方法同时检出最多的腹泻相关病原体为轮状病毒A群。

表1 3种方法对102例感染性腹泻标本病原体检出情况

2.2电化学芯片法和FilmArray法分别与“金标准”方法检测结果比较 以“金标准”方法作为对照，分别与电化学芯片法和FilmArray法进行统计学比较。电化学芯片法与“金标准”方法比较，灵敏度为90.24%，特异度为80.00%，2种方法检测结果差异有统计学意义(χ2=44.092，P<0.05)。FilmArray法与“金标准”方法比较，灵敏度为97.56%，特异度为70.00%，2种方法检测结果差异有统计学意义(χ2=55.490，P<0.05)。见表2。

表2 电化学芯片法和FilmArray法分别与“金标准”方法结果比较

2.3电化学芯片法和FilmArray法分别与“金标准”方法一致性比较 以“金标准”方法作为对照，分别与电化学芯片法和FilmArray法进行一致性比较并进行Kappa检验。电化学芯片法与“金标准”方法比较，检测结果完全和部分一致的标本有90例，不一致的标本有12例，一致率为88.24%，进行一致性检验，Kappa值为0.653，2种方法在统计学上具有较好的一致性。FilmArray法与“金标准”方法比较，检测结果完全和部分一致的标本有94例，不一致的标本有8例，一致率为92.16%，进行一致性检验，Kappa值为0.731，2种方法在统计学上具有较好的一致性。见表3。

表3 电化学芯片法和FilmArray法分别与“金标准”方法一致性比较

续表3 电化学芯片法和FilmArray法分别与“金标准”方法一致性比较

3 讨 论

通过对本院儿科门诊腹泻患儿新鲜粪便标本进行检测，“金标准”方法的阳性检出率为80.39%，感染性腹泻以轮状病毒感染为主，且混合感染发病率高，与张辉等[4]调查研究基本一致。“金标准”方法发现20例诺如病毒感染患儿，占比较高，应引起注意。诺如病毒感染后，极易在同龄儿童聚集地，如学校引起暴发流行[5-6]。细菌性病原体以致病性大肠埃希菌为主，未发现沙门菌，与以往报道有差别[7]，可能与采集标本时间、地点、标本量有关。未发现志贺菌和霍乱弧菌等引起法定传染病的致病菌，且在实际工作中发现，采用普通细菌培养方法诊断感染性腹泻致病菌的阳性检出率低于FilmArray法[8-9]。在感染性腹泻的诊断中，分子诊断技术是对传统细菌培养方法的良好补充。

在检测腹泻患儿标本中发现，应用FilmArray法检测准确率高，与国外报道一致，标本周转时间2.0 h左右，耗时短，仅需一步手工加样，操作简单[10-11]，但此方法每台仪器只能检测1例患儿标本，通量严重不足，单标本检测费用较高[12]，患儿家庭负担较重，目前在国内不适合开展大规模诊断。电化学芯片法与“金标准”方法结果比较，灵敏度为90.24%，特异度为80.00%，一致率为88.24%，检测结果整体情况较好。电化学芯片法发现多重感染性腹泻病原体能力不如FilmArray法[13-14]，标本周转时间约为5.5 h，多于FilmArray法，但是少于实时荧光定量PCR方法[15]，可同时检测32例患儿标本，通量高，手工操作步骤少，在一定程度上降低人为操作误差，人员经简单培训，即可进行检测，便于开展，且标本检测成本较FilmArray法大幅降低。

电化学芯片法检测结果与其他方法比较时，也发现了一些问题。(1)整体阳性检出率为76.47%，还需要进一步提高；(2)检测结果的准确率还需要进一步提高；(3)在混合感染中，该方法的鉴别能力不足，应继续优化试剂成分，以达到更好的效果。

总之，多重不对称PCR-电化学芯片技术，系统灵敏度、特异度较好，具有良好的临床应用价值。