肺炎支原体肺炎患儿血浆miR-223、miR-21水平变化及其与T淋巴细胞亚群、炎症因子的关系研究*

梁 淳，尹 蕾，田 伟

河北省邯郸市中心医院检验科，河北邯郸 056008

肺炎支原体肺炎(MPP)是儿童临床上常见的获得性肺炎之一，潜伏期较长[1-2]。因MPP发病早期隐匿，且复发率高，久治不愈，如未及时治疗，易威胁患儿生命[3]。微小RNA(miRNA)是新发现的一类非编码RNA，在不同疾病人群中，血浆miRNA表达存在明显差异[4]。有研究显示，T淋巴细胞可激活机体免疫系统维持免疫功能平衡，而炎症因子可激活炎性反应，两者均可能参与了MPP的发生、发展[5]。与血清检测比较，血浆标本检查前放置的时间相对较短，可有效避免外界因素对检测结果造成的干扰，并节约检测时间。本文主要研究MPP患儿血浆miR-223、miR-21水平变化及其与T淋巴细胞亚群、炎症因子的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院2017年2月至2019年2月收治的MPP患儿120例作为观察组，其中男67例，女53例；年龄5～14岁，平均(10.80±2.55)岁。纳入标准：(1)所有MPP患儿均与《儿童肺炎支原体肺炎诊治专家共识(2015版)》[6]中所制订的MPP相关诊断标准相符；(2)无哮喘、心肌炎及心包炎等其他相关炎症疾病；(3)入院前尚未接受相关治疗。排除标准：(1)伴有其他常见呼吸系统疾病；(2)存在免疫缺陷；(3)临床病历资料缺失。另取同期于本院进行体检的健康儿童120例作为对照组，其中男69例，女51例；年龄5～15岁，平均(10.84±2.58)岁。2组儿童年龄、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有受试者家属均在知情同意书上签字，本研究获得医院伦理委员会审批通过。

1.2研究方法 (1)采用实时荧光定量PCR法检测血浆miR-223、miR-21水平。首先采用血浆总RNA提取试剂盒(购自德国Qiagen公司)进行血浆总RNA的提取，并进行纯化。紫外分光光度计测定260 nm的吸光度(A)值,计算RNA浓度，控制其处于0.15～1.00。随后进行反转录，严格按照miScriptⅡ反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA。总反应体系为20 μL，反应条件为37 ℃ 60 min、95 ℃ 5 min。采用无酶水稀释后保存于-20 ℃冰箱中备用。由德国Qiagen公司设计合成相关引物，根据miScript SYBR Green Kit说明书完成反应混合物的配制，每个反应体系为15 μL，采用罗氏LightCycler480Ⅱ荧光定量PCR仪检测，反应条件如下：95 ℃预激活15 min，94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共45个循环。每个反应孔均设置3个复孔，以内参实现归一化。miR-223上游引物：5′-CAG AAA GCC CAA TTC CAT CT-3′；下游引物：5′-GGG CAA ATG GAT ACC ATA CC-3′。miR-21上游引物：5′-ACA CTC CAG CTG GGT AGC TTA TCA GAC TGA-3′；下游引物：5′-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GT-3′。待测miRNA水平采用相对定量软件Ver1.0根据2-ΔΔCt法计算获得。(2)以流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞亚群水平。分别取2组儿童的外周血标本100 μL，加入试剂混匀后放置在避光室温条件下进行时长为30 min的孵育，随后加入红细胞裂解液进行红细胞的裂解，以PBS清洗，控制细胞浓度为1×106个/mL，采用流式细胞仪收集细胞，并完成CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞的检测及CD4+/CD8+的计算。(3)采用酶联免疫吸附试验法检测血清白细胞介素(IL)-6、IL-8、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平，分别于入院后第2天清晨采集观察组儿童空腹状态下及对照组儿童体检时静脉血5 mL，以3 000 r/min离心20 min，取上清液，置于冰箱中保存备用，操作严格遵从相关试剂盒说明书完成，试剂盒均购自武汉博士德生物科技有限公司。

2 结 果

2.12组儿童血浆miR-223、miR-21水平比较 观察组儿童血浆miR-223、miR-21水平均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组儿童血浆miR-223、miR-21水平比较

2.22组儿童外周血T淋巴细胞亚群水平比较 观察组儿童外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞及CD4+/CD8+水平均显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。2组儿童外周血T淋巴细胞的检测结果见图1。

表2 2组患儿外周血T淋巴细胞亚群水平比较

2.32组儿童血清炎症因子水平比较 观察组儿童血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 2组儿童血清炎症因子水平比较

2.4观察组患儿血浆miR-223、miR-21水平与T淋巴细胞亚群、炎症因子的相关性分析 Pearson相关分析结果显示，观察组患儿血浆miR-223、miR-21水平与外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞及CD4+/CD8+水平呈负相关(P<0.05)；而与血清IL-6、IL-8、TNF-α水平呈正相关(P<0.05)。见表4。

图1 2组儿童外周血T淋巴细胞的检测结果

表4 观察组患儿血浆miR-223、miR-21水平与T淋巴细胞亚群、炎症因子的相关性分析

3 讨 论

MPP是一种多发生于5～15岁儿童肺炎支原体(MP)感染的流行病，若不进行及时、有效的干预，随着病情的不断进展可能引发患儿免疫功能紊乱，同时可能导致心、肝、肾、脑等多器官损伤，对患儿的生命健康安全造成极大威胁[7-9]。随着近年来相关研究的不断深入，越来越多的研究报道证实体液免疫及细胞免疫中的大量炎症因子均介导了MP的发病过程[10-12]。患儿因自身免疫系统发育尚未完善，炎症因子在MP感染过程中的免疫机制、炎性反应发生机制仍存在一定的争议，需进一步研究探讨。miRNA是一种可有效调节真核细胞基因表达的单链小片段RNA，具有调控炎症因子及介质表达的作用[13-14]。miR-223、miR-21是近年来所发现的新型miRNA，可通过对下游IL-6、IL-10等炎症因子的表达产生影响，进一步促进相关疾病的发生、发展。相关研究报道显示，miR-223在食管癌患者外周血中表达显著上调[15]，而miR-21在肺癌患者外周血中表达明显上调[16]，因此，笔者推测两者可能参与了恶性肿瘤的发生、发展过程。本文通过研究MPP患儿血浆miR-223、miR-21水平变化及其与T淋巴细胞亚群、炎症因子的关系，旨在为MPP患儿的诊治提供新的思路和靶点。

本研究结果显示，观察组儿童血浆miR-223、miR-21水平显著高于对照组，提示随着血浆miR-223、miR-21水平的不断升高，MPP发生风险随之升高。分析原因，笔者认为miR-223、miR-21均与炎症密切相关，可能通过与多种抗炎因子靶基因相结合，继而对相关靶基因的表达产生抑制，发挥生物学功能，促进MPP的发展[17-18]。此外，观察组儿童外周血中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞及CD4+/CD8+水平显著低于对照组，这与张晓峰等[19]的研究报道相符。其中CD3+T淋巴细胞在一定情况下可反映机体T淋巴细胞活化情况，进而反映机体免疫状况，其水平降低说明T淋巴细胞活化受到抑制；CD4+T淋巴细胞则可刺激T淋巴细胞转化为效应细胞或活化巨噬细胞，进而发挥免疫作用，其水平的降低间接反映免疫功能受到抑制；CD8+T淋巴细胞具有灭杀感染靶细胞的作用，其水平的降低表明机体灭杀感染细胞的能力降低；CD4+/CD8+降低反映机体免疫力的下降。笔者推测，MPP患儿外周血中免疫系统可能出现一定程度的紊乱。另外，观察组儿童血清IL-6、IL-8、TNF-α水平显著高于对照组，其主要原因为当患儿的肺部发生感染或感染加重时，肺内的局部炎症因子会出现“瀑布式”链式反应，继而促进大量炎症因子、巨噬细胞的快速浸润和扩散[20]。肺泡上皮细胞及肺血管内皮细胞受损后，中性粒细胞与炎症因子会快速进入肺泡腔，继而促进炎性反应的加剧，进一步增加上述各项血清炎症因子的释放。Pearson相关分析结果显示，观察组患儿血浆miR-223、miR-21水平与外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞及CD4+/CD8+水平呈负相关，而与血清IL-6、IL-8、TNF-α水平呈正相关，这充分说明血浆miR-223、miR-21介导MPP发生、发展的主要机制可能和调节T淋巴细胞亚群及炎症因子水平密切相关。

综上所述，MPP患儿血浆miR-223、miR-21水平明显较健康儿童升高，且二者与T淋巴细胞亚群和炎症因子有关，初步证实miR-223、miR-21具有成为MPP防治新靶点的潜力。