褪黑素对大鼠挤压综合征模型骨骼肌缺血再灌注损伤的影响

胡敏，於四军

(1.深圳市罗湖区人民医院 心内科，广东 深圳 518000；2.中国人民解放军总医院第三医学中心 心内科，北京 100039)

挤压综合征是由于躯干或四肢等肌肉及血供丰富部位，经过外界持续性挤压损伤后出现与缺血再灌注损伤相关的一系列病理生理改变，以横纹肌溶解、循环衰竭及急性肾损伤为特点的临床危重症疾病，多发生在战争灾害、恐怖袭击、地震、山体滑坡等事件中[1]。目前挤压综合征以大量补液及肾脏替代疗法为主要治疗手段[2]。由于灾害现场环境及医疗条件的限制，很多患者并不能在早期接受肾脏替代治疗，因此，急性肾损伤的发生率并没有得到有效的降低[3]。而挤压综合征最主要的特征是在缺血再灌注组织产生大量的氧自由基，氧自由基引起缺血再灌注过程中氧化损伤、横纹肌溶解。氧自由基是挤压综合征的主要病因[4]。因此，自由基清除剂的应用为挤压综合征的药物治疗提供了新的思路。有研究表明，褪黑素在大鼠的心肌、肝脏等器官缺血再灌注中发挥清除自由基及抗氧化作用，对靶器官具有保护作用[5-6]。因此，本实验通过建立挤压综合征动物模型来观察褪黑素对大鼠酸碱平衡紊乱、氧化应激损伤、横纹肌溶解及存活率等方面的影响，为挤压综合征的早期治疗、减少挤压综合征并发症的发生以及提高其生存率提供依据。

1 材料与方法

1.1 造模与分组

SPF 级健康雄性wistar 大鼠，体重300 ～350 g，由军事科学院动物中心供应，实验动物许可证号编号为：SCXK-( 军)2012-0004。

实验大鼠在SPF 级条件下饲养，自由采食与饮水，实验室室温控制在23℃左右，室内湿度在(55±15)%，日光灯明暗12 h 交替照射。将Isamu Murata 等挤压综合征造模方法加以利用改进[7]，利用5% 戊巴比妥钠溶液以50 mg/kg 剂量腹腔麻醉大鼠，利用卡式止血带挤压大鼠后肢根部，止血带拉力等同于3 kg 重物的压力，5 h后撤除止血夹恢复挤压肢体血流灌注，其间大鼠能自由获取食物与水。

观察大鼠生存率的试验中，保证各组大鼠存活10 只的前提下，取大鼠分为Sham 组(n=10)、CS 组(n=30)、NS 组(n=25)、MEL 组(n=16)，观察再灌注48 h 各组大鼠死亡的时间点进行生存曲线分析。另取大鼠随机分为四组：空白组(Sham 组，n=10，除麻醉5 h 外无任何处理)、对照组(CS 组，n=10，挤压造模后无处理，再灌注6 h)、氯化钠组(NS 组，n=10，解压前给予10 mL/kg 氯化钠扩容，再灌注6 h) 及褪黑素组(MEL组，n=10，解压前给予10 mL/kg 褪黑素溶液，再灌注6 h)。所有给药均在解除压迫前即刻通过鼠尾静脉5 min内推注。

1.2 试剂和仪器

褪黑素(Sigma 公司，美国)；戊巴比妥钠(Sigma公司，美国)；血气生化测试卡片G3+( 雅培公司，美国)；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT) 和丙二醛(MDA) 测定试剂盒( 南京建成生物工程研究所)。

仪器：倒置显微镜(Olympus，日本)；雅培i-STAT300血气分析仪( 雅培公司，美国)；RM6240 多道生理信号采集系统(成都仪器厂)；酶标仪(Beckman 公司，美国)；日立7600 全自动生化分析仪(日立高新技术有限公司)。

此外，4% 多聚甲醛、乙醇、二甲苯、固体石蜡、HE 染色等均由北京雪邦病理实验室提供。

1.3 标本留取方法

再灌注6 h 时，利用5%戊巴比妥钠溶液以50 mg/kg剂量腹腔麻醉大鼠，开腹，游离降主动脉及髂动脉；在左右髂动脉分叉处穿刺进针，可穿刺取血，但穿刺前利用肝素盐水湿润注射器以防止血液凝固，通过腹主动脉穿刺取血约5 mL，滴取动脉血数滴于血气生化测试卡片G3+ 采血孔内，通过手持式i-STAT300 血气分析仪测量动脉血气，并记录数据；剩余血液以2 500 r/min，离心20 min，取上清液，测量各组血清中GSH-Px、SOD、CAT 的活性以及MDA 的含量，并利用全自动生化分析仪测量各待测血清钾离子、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH) 的含量。同时，解剖大鼠双下肢腓肠肌，用冰生理盐水冲洗干净，置于4% 多聚甲醛固定24 h，用于制作石蜡切片。

1.4 主要指标测定方法

依据试剂盒说明书检测GSH-Px、SOD、CAT 及MDA。利用全自动生化分析仪测定各组大鼠血清钾离子、CK 及LDH 含量。

1.5 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件分析数据。计量资料以±s表示。首先验证四组数据是否服从正态分布及方差齐性；正态分布、方差齐的数据多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD 法，方差不齐时采用Dunnett's 法；不服从正态分布资料的数据采用非参数秩和检验；生存分析采用Kaplan-Meier 法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 褪黑素提高挤压综合征大鼠生存率

CS 组大鼠的生存率为20%，NS 组大鼠的生存率29.2%，MEL 组大鼠的生存率为56.3%，MEL 组大鼠生存率明显高于CS 组与NS 组，log-rank 检 验χ2为23.07，P＜0.01，差异有统计学意义。各组生存曲线见图1。

图1 各组大鼠生存曲线

2.2 褪黑素改善酸碱平衡紊乱

与Sham 组比较，CS 组血液中pH 值、HCO3-和剩余碱含量显著下降，差异有统计学意义(P＜0.05)；与CS 组比较，NS 组血液中pH 值、HCO3-和剩余含量无统计学差异；与CS 组比较，MEL 组血液中pH 值、HCO3-和剩余含量显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠动脉血气比较(± s)

表1 各组大鼠动脉血气比较(± s)

注：与Sham 组比较，①P ＜0.05；与CS 组比较，②P ＜0.05。

组别 n pH HCO3-/(mmol·L-1) BE/(mmol·L-1)Sham 组 10 7.44±0.01 29.5±0.8 3.4±0.8 CS 组 30 7.30±0.02① 18.2±0.9① -8.5±1.0①NS 组 25 7.32±0.02 21.0±1.2 -6.8±0.9 MEL 组 16 7.41±0.03② 26.8±1.1② 1.5±1.1②

2.3 褪黑素减轻横纹肌溶解

CS 组血清中钾、CK、LDH 含量明显高于Sham组(P＜0.05)；与CS 组相比，MEL 组血清中钾、CK、LDH 显著降低(P＜0.05)；而NS 组与CS 组比较，血清中钾、CK、LDH 含量无统计学差异。见表2。

表2 各组大鼠血清横纹肌溶解标志物含量比较(± s)

表2 各组大鼠血清横纹肌溶解标志物含量比较(± s)

注：与Sham 组比较，①P ＜0.05；与CS 组比较，②P ＜0.05。

组别 n 钾/(mmol·L-1) CK/(U·L-1) LDH/(U·L-1)Sham 组 10 4.11±0.36 353±58 150±39 CS 组 30 7.59±0.48① 27 336±685 1① 2 780±360①NS 组 25 7.30±0.48 25 021±524 2 2 622±249 MEL 组 16 6.01±0.45② 13 270±362 4② 1 488±312②

2.4 褪黑素缓解氧化应激

CS 组血清中GSH-Px、SOD、CAT的活性低于Sham 组，MDA 的含量高于Sham 组，差异有统计学意义(P＜0.05)；MEL 组血清中GSH-Px、SOD、CAT 的活性高于Sham 组，MDA 的含量低于Sham 组，差异有统计学意义(P＜0.05)，而NS 组中GSH-Px、SOD、CAT、MDA 水平与CS 组比较，差异无统计学意义，见表3。

表3 各组大鼠血清中GSH-Px、SOD、CAT、MDA 水平比较(± s)

表3 各组大鼠血清中GSH-Px、SOD、CAT、MDA 水平比较(± s)

注：与Sham 组比较，①P ＜0.05；与CS 组比较，②P ＜0.05。

SH-Px/(U·mL-1) SOD/(U·mL-1) CAT/(U·mL-1) 77.6±7.23 319.90±25.20 42.1±1.78 组别 n GMDA/(μmol·L-1)Sham 组 10 2.65±0.39 CS 组 30 48.8±5.31① 179.20±18.42① 25.1±2.65① 6.89±0.39①NS 组 25 52.7±3.48 183.64±15.49 25.7±3.77 6.56±0.84 MEL 组 16 64.7±4.32② 255.86±26.00② 32.3±2.82② 4.54±0.61②

2.5 腓肠肌光镜下HE 染色结果

Sham 组腓肠肌纤维间未见水肿及炎症细胞浸润，肌肉纤维正常分布；CS 组、NS 组腓肠肌纤维间质水肿明显，肌纤维结构严重破坏，骨骼肌横纹紊乱；MEL 组肌肉纤维间可见轻度水肿，纤维组织稍紊乱，其形态结构明显好于CS 组与NS 组。见图2。

图2 各组大鼠腓肠肌光镜下HE 染色表现(×200)

3 讨 论

挤压综合征是由于四肢或躯干等肌肉丰富部位遭受长时间挤压，在解除压迫后出现的缺血再灌注损伤，多发生在战争灾害、恐怖袭击、地震、山体滑坡等灾害性事件中，主要表现出肢体肿胀、横纹肌溶解、酸中毒、高钾血症、急性肾损伤等主要临床特征。Isamu Murata等[7]通过止血带挤压大鼠双下肢的方法建立了挤压综合征动物模型，评估造模大鼠的的临床特征，证实该模型具有较好的稳定性。近些年来，褪黑素在缺血再灌注损伤实验中应用广泛，特别是在肾脏、肝脏及心肌等组织缺血再灌注损伤过程中具有显著疗效[8-10]。本实验研究中CS 组与MEL 组实验结果表明，褪黑素能显著改善减轻下肢缺血再灌注损伤，主要表现在缺血再灌注损伤过程中酸碱平衡紊乱、横纹肌溶解及氧化损伤程度得到显著改善，外源性褪黑素干预也同时提高了造模大鼠48 h生存率。

缺血再灌注损伤与自由基的形成密切相关，自由基主要由再灌注过程中大量产生的活性氧(ROS) 转化而来。ROS 主要在线粒体中产生[11]，线粒体电子传递链复合物的氧化还原状态快速变化，造成再灌注时大量的电子加速传递给氧，线粒体中ROS 形成大大提高。ROS 诱导胞浆中酶发生变性，通过脂质过氧化过程使细胞膜完整性遭到破坏。ROS 介导的浆网功能障碍也导致大量细胞内钙超载，导致线粒体通透性转换孔开放，从而导致细胞坏死。褪黑素为非极性结构，可以穿透细胞膜，在线粒体中浓度最高[12]。有研究表明，褪黑素能抑制线粒体通透性转换孔开放，减轻缺血再灌注损伤[13]。本研究检测血清中横纹肌溶解标志物—血清钾、CK 及LDH 的释放并观察腓肠肌病理改变来反映缺血再灌注损伤后横纹肌溶解程度，结果表明褪黑素对挤压综合症模型受伤的肌肉细胞具有保护作用。

机体氧化与抗氧化过程处于相互协调及的动态平衡状态。这种动态平衡一旦被打破，主要表现为缺血再灌注损伤，大量氧自由基形成、中粒细胞激活、线粒体膜电位改变、细胞膜稳定性改变、细胞内皮功能失调等一系列病理生理变化[14]。褪黑素一直以来被认为是一种有效的自由基清除剂[12,15]，同时褪黑激素能促进抗氧化酶如GSH-Px、SOD 和CAT 的活性，从而使其间接发挥抗氧化剂的功能[16-17]。褪黑素的这些特征有效地减轻了氧自由基引起的组织损伤[18]。本实验结果表明，MEL 组中GSH-Px、SOD、CAT 的抗氧化活性显著高于CS 组，证实了褪黑素通过直接清除氧自由基、增加内源性抗氧化酶系统的活力而增加对挤压综合征大鼠缺血再灌注损伤的保护作用。

挤压综合征缺血再灌注损伤引起脂质过氧化反应[19]。脂质膜上不饱和脂肪酸引起级联反应，从而使细胞膜的流动性和通透性发生改变，最终导致细胞结构和功能的改变，生成有毒性代谢终产物MDA，其含量能有效地反映脂质膜的脂质过氧化反应程度[20]。

褪黑素由人体松果体分泌，正常人体内含有少量的褪黑素，人体内含有一定浓度的褪黑素能起到抗氧化作用。其具有较小的毒副作用，目前，没有相关资料显示使用褪黑素会出现严重的毒副作用。一项关于40 名[21]晚期肿瘤患者使用大剂量褪黑素(700 mg/d) 的研究发现，6 位患者恶性肿块出现短暂的减小。De La Lastra等[22]利用褪黑素治疗动物胃部缺血在灌注损伤发现，20 mg/kg 的褪黑素剂量能起到最有效的抗氧化作用。此外，我们需要进一步思考的是褪黑素能否应用于灾害现场挤压综合征的治疗？因此需进一步研究褪黑素的药效动力学及药物的毒副作用，来指导给药剂量及给药方式。本研究证实，褪黑素对挤压综合征骨骼肌缺血再灌注损伤具有保护作用，能提高挤压综合征模型大鼠的生存率，但褪黑素溶液最佳给药剂量及给药途径仍需我们进一步探究。