雷公藤甲素固体脂质纳米粒的制备及其抗慢性皮炎湿疹的作用研究

汪五清 贺燕妮 曾义斌 张彤 朱瑞政 左付国

摘 要 目的：制备雷公藤甲素固体脂质纳米粒（triptolide-solid lipid nanoparticles， TPL-SLN），并考察其抗慢性皮炎湿疹的作用。方法：以Compritol 888 ATO为油相、Tween 80为表面活性剂、大豆卵磷脂和Transcutol HP为助表面活性剂，通过处方筛选，制备TPL-SLN。以不同浓度的2，4-二硝基氯苯丙酮溶液为致敏剂和激发剂，建立小鼠耳部慢性皮炎湿疹模型，考察TPL-SLN对慢性湿疹造成的肿胀症状以及对血清中细胞因子分泌的影响。结果：本研究制备的TPL-SLN粒径为（90.69±1.82）nm，且分布均匀，能有效抑制小鼠皮炎湿疹造成的耳肿胀症状，可显著降低皮肤炎性因子IFN-g、IL-4的表达。结论：本研究制备的TPL-SLN能够有效改善小鼠皮炎湿疹症状，有望为雷公藤甲素治疗慢性皮炎湿疹提供一种新的给药策略。

关键词 雷公藤甲素 固体脂质纳米粒 纳米经皮给药系统 慢性皮炎湿疹

中图分类号：R979.5； R944.9 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2021）01-0014-05

*基金项目：上海市卫生局中医药科研基金项目（2012L073A）

Development of triptolide-solid lipid nanoparticles for treating chronic dermatitis eczema*

WANG Wuqing1**， HE Yanni1， ZENG Yibin1， ZHANG Tong1， ZHU Ruizheng1， ZUO Fuguo2***（1. Department of Dermatology， the Central Hospital of Minhang District， Shanghai 201100， China； 2. Department of Dermatology， East Hospital， School of Medicine， Tongji University， Shanghai 200120， China）

ABSTRACT Objective： To prepare triptolide-solid lipid nanoparticles （TPL-SLN） and investigate their effect on chronic dermatitis and eczema. Methods： Triptolide-solid lipid nanoparticles were prepared using Compritol 888 ATO as the oil phase， Tween 80 as the surfactant， soybean lecithin and Transcutol HP as the co-surfactant. A mice model with chronic ear dermatitis and eczema was established by sensitizing and stimulating using 2，4-dinitrochlorobenzene solution with different concentration to investigate their effect on swelling， skin redness and the serum concentrations of IFN-γ， IL-4 and IL-8. Results： The prepared TPL-SLN had a particle size of 90.69±1.82 nm and a uniform distribution， and could effectively inhibit the ear swelling， erythema and other symptoms caused by dermatitis and eczema in mice and significantly reduce the expression of skin inflammatory factors IFN- and IL-4. Conclusion： The TPL-SLN can effectively improve the symptoms of dermatitis and eczema in mice and is expected to provide a new delivery strategy for triptolide for the treatment of chronic dermatitis and eczema.

KEy WORDS triptolide； solid lipid nanoparticles； nano transdermal drug delivery system； chronic dermatitis eczema

雷公藤甲素（triptolide，TPL）是中藥雷公藤的主要活性成分，具有抗炎、镇痛、免疫调节、抗肿瘤等理化性质，常用于皮肤湿疹、类风湿性关节炎、免疫性疾病及恶性肿瘤等[1-2]。目前上市的雷公藤制剂有雷公藤片、昆仙胶囊、雷公藤多苷片、昆明山海棠片等，但雷公藤的传统口服制剂存在半衰期（t1/2）短、生物利用度低、不良反应大等问题[3]。而经皮给药制剂具有避免肝脏“首过效应”、延长药物t1/2、降低药物不良反应等特点，因此，将雷公藤甲素制备成外用制剂是提高局部药物浓度、降低不良作用的重要途径。

皮肤对药物的屏障作用是阻碍外用制剂发挥疗效的重要因素，而将药物制备成纳米制剂是采用制剂方法促透皮的重要手段。其中固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）可将药物包封于类脂核中，SLN不仅具备脂质体的安全性，同时还具有聚合物纳米粒的稳定性，可实现药物的缓、控释和靶向递送[4]。因此，本研究以TPL为模型药物制备TPL-SLN，并对其抗皮肤慢性湿疹的药效学进行考察。

2）分组及给药 将54只雄性ICR小鼠随机分为6组：空白对照组，模型组，TPL-SLN低（15 mg/kg）、中（45 mg/kg）、高剂量组（90 mg/kg）和雷公藤多苷片组（10 mg/kg）。按上述慢性皮炎湿疹方法造模，小鼠于致敏后开始给药，每日1次，连续给药14 d。空白对照组和模型组给予不含药的SLN处理；实验组分别局部给予低、中、高浓度的TPL-SLN；雷公藤多苷片组通过灌胃给药。并于每次激發后测量每组小鼠的耳厚度。

3）皮肤炎性因子的测定 于最后一次激发24 h后处死小鼠，断头取血置于肝素管中，于3 000 r/min条件下离心30 min，上层血清保存于-80 ℃冰箱中备用。采用ELISA试剂盒测定血清中炎性因子IFN-g、IL-4和IL-8的含量。

2 结果

2.1 方法学验证

HPLC测定不同浓度（c，2、4、6、8、10 mg/ml）雷公藤甲素溶液的峰面积（A），测得TPL在2～10 mg/ml浓度范围内的线性关系为：A=41.786c-3.979，R2=0.999 8（n=5）。经方法学验证，本研究建立的HPLC含量测定方法的精密度、稳定性、重复性、回收率等均符合要求。

2.2 TPL-SLN处方优化

2.2.1 脂质载体的选择

通过考察TPL在不同固体脂质中的溶解性发现TPL在硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、Compritol 888 ATO、棕榈酸中的油水分配系数分别为1.12±0.05、0.72±0.08、1.72±0.08和1.43±0.06，结果表明TPL在Compritol 888 ATO中的具有较高的溶解度。因此，确定Compritol 888 ATO为脂质材料。

2.2.2 助表面活性剂的筛选

通过考察大豆卵磷脂与常见的几种助表面活性剂的互溶情况确定助表面活性剂的种类，结果表明正己醇和Transcutol HP均能和大豆卵磷脂互溶，但正己醇对皮肤、黏膜具有刺激性。因此，本研究以Transcutol HP和大豆卵磷脂（1∶1）作为助表面活性剂。

2.2.3 表面活性剂/助表面活性剂的比例确定

绘制KM值为1∶1，2∶1，3∶1的伪三元相图，根据乳化面积的大小确定表面活性剂和助表面活性剂的比例，结果表明，当KM=2∶1时，该体系具有较好的乳化能力（图1），即表面活性剂（Tween 80）和助表面活性剂的（大豆卵磷脂-Transcutol HP=1∶1）比例确定为2∶1。

2.2.4 脂质与表面活性剂的比例

结果表明，脂质材料增加，包封率无显著变化（P>0.5，表1），但载药量出现逐渐降低的趋势（P<0.5，表1），考虑到药物的利用率，本研究中Compritol 888 ATO和Tween 80的用量比为1∶2。

2.2.5 药脂比的确定

结果表明，随着投药量的增加，SLN对药物的包封率逐渐降低，而载药量有上升的趋势，综合药脂比对这2种指标的影响，确定药物的用量为脂质载体的10%。

2.3 TPL-SLN理化性质表征

2.3.1 粒径分布

制备的TPL-SLN粒径较小，大小为（90.69±1.82）nm；粒径均匀，呈正态分布，PDI为（0.106±0.018）nm（图2）。

2.3.2 包封率、载药量的测定

测得的SLN对TPL的包封率、载药量分别为

（96.38±7.96）%，（10.21±0.98）%。

2.4 TPL-SLN药效学研究

1）小鼠耳慢性皮炎湿疹模型的构建 最后一次激发后，对照组和模型组小鼠的耳厚度分别为（0.236±0.009）mm和（0.333±0.016）mm（P<0.01，图3），表明ICR小鼠经不同浓度的2，4-二硝基氯苯丙酮溶液致敏、激发处理后，能成功引发小鼠耳慢性皮炎湿疹。

2）分组及给药 每只小鼠于每次激发后测量耳厚度，连续测定10 d，结果表明，对照组小鼠耳厚度无明显变化，而模型组小鼠出现明显肿胀的现象；小鼠经TPL-SLN低剂量组处理后，耳厚度与模型组之间无显著性差异；而与模型组相比，经TPL-SLN中、高剂量组以及雷公藤多苷片处理的小鼠耳肿胀症状明显改善（表3）。

3）皮肤炎性因子的测定 经2， 4-二硝基氯苯丙酮溶液致敏、激发处理后，与对照组相比，模型组中IFN-g、IL-4含量明显升高；与模型组相比，TPL-SLN中、高剂量组和雷公藤多苷片组能显著降低IFN-g、IL-4的血清含量（图4）。结果显示，小鼠耳部经致敏、激发，以及不同制剂处理后，血清中的IL-8含量无明显变化，表明小鼠耳慢性皮炎湿疹与炎性因子IL-8直接关系（图4）。

3 讨论

SLN的制备方法有高压均质法、超声法、乳化蒸发-低温固化法、薄膜分散发、微乳法等[11-13]。与其他制备方法相比较，采用微乳法制备TPL-SLN具有流程简单、缩短制剂制备时间、不残留有机溶剂、对仪器要求低等特点。本研究通过处方筛选，采用微乳法制备的纳米载体具有粒径小，分布均匀，包封率和载药量高等特点。

本研究以浓度为7%的2， 4-二硝基氯苯丙酮溶液对实验动物致敏，致敏后再经低浓度的2， 4-二硝基氯苯丙酮溶液多次激发，成功建立ICR小鼠慢性皮炎湿疹模型。藥效学结果表明，本研究制备的TPL-SLN高剂量能明显改善模型小鼠的炎症反应，缓解甚至消除模型动物的耳肿胀症状，与阳性对照药雷公藤多苷片效果相当。

目前，导致皮炎湿疹的作用机制较为复杂，而机体的免疫系统在其中发挥了必不可少的作用并受到一定的影响。其中，细胞因子作为免疫调节的重要成分，通过测定其表达的水平，可考察TPL-SLN在治疗慢性皮炎湿疹中的部分作用机制。ELISA结果显示，TPL-SLN能显著降低血清中TNF-γ和IL-4的表达，而对IL-8的分泌未见有明显调控作用。结果表明TPL-SLN可调节T细胞亚群的失衡情况，治疗机制可能与调节T、B淋巴细胞有关[14]。

参考文献

[1] Yang M， Gu Y， Yang D， et al. Development of triptolidenanoemulsion gels for percutaneous administration： physicochemical， transport， pharmacokinetic and pharmacodynamic characteristics[J/OL]. J Nanobiotechnol， 2017， 15（1）： 88. doi： 10.1186/s12951-017-0323-0.

[2] Gu Y， Yang M， Tang X， et al. Lipid nanoparticles loading triptolide for transdermal delivery： mechanisms of penetration enhancement and transport properties[J/OL]. J Nanobiotechnol， 2018， 16（1）： 68. doi： 10.1186/s12951-018-0389-3.

[3] Gong X， Chen Y， Wu Y. Absorption and metabolism characteristics of triptolide as determined by a sensitive and reliable LC-MS/MS method[J]. Molecules， 2015， 20（5）： 8928-8940.

[4] Wissing SA， Kayser O， Muller RH. Solid lipid nanoparticles for parenteral drug delivery[J]. Adv Drug Deliv Rev， 2004， 56（9）： 1257-1272.

[5] Gu Y， Tang X， Yang M， et al. Transdermal drug delivery of triptolide-loaded nanostructured lipid carriers： preparation， pharmacokinetic， and evaluation for rheumatoid arthritis[J]. Int J Pharm， 2019， 554： 235-244.

[6] Zhuang CY， Li N， Wang M， et al. Preparation and characterization of vinpocetine loaded nanostructured lipid carriers （NLC） for improved oral bioavailability[J]. Int J Pharm， 2010， 394（1/2）： 179-185.

[7] Zhang C， Peng F， Liu W， et al. Nanostructured lipid carriers as a novel oral delivery system for triptolide： induced changes in pharmacokinetics profile associated with reduced toxicity in male rats[J]. Int J Nanomedicine， 2014， 9： 1049-1063.

[8] Zhao L， Wang Y， Zhai Y， et al. Ropivacaine loaded microemulsion and microemulsion-based gel for transdermal delivery： preparation， optimization， and evaluation[J]. Int J Pharm， 2014， 477（1/2）： 47-56.

[9] Kobayashi T， Glatz M， Horiuchi K， et al. Dysbiosis and Staphylococcus aureus colonization drives inflammation in atopic dermatitis[J]. Immunity， 2015， 42（4）： 756-766.

[10] Kim D， Kobayashi T， Nagao K. Research techniques made simple： mouse models of atopic dermatitis[J]. J Invest Dermatol， 2019， 139（5）： 984-990.

[11] 郭童林， 甄艳杰， 赵雨薇， 等. 槲皮素固体脂质纳米粒对Ab25-35损伤的PC12细胞雌激素样神经保护作用的研究[J]. 中国药理学通报， 2020， 36（10）： 1409-1415.

[12] 黄苏莉， 吴贻明， 包瑞， 等. 基于TPGs表面修饰的雷公藤甲素固体脂质纳米粒的制备与质量评价[J]. 药物评价研究， 2020， 43（7）： 1283-1288.

[13] Gupta S， Wairkar S， Bhatt LK. Isotretinoin and alphatocopherol acetate-loaded solid lipid nanoparticle topical gel for the treatment of acne[J]. J Microencapsul， 2020， 37（8）： 557-565.

[14] 柳文红. 藏药十八味欧曲膏对大鼠湿疹模型血清中IL-4、IFN-g表达的影响[D]. 兰州： 甘肃中医学院， 2014.