乳腺癌中miR⁃141表达与临床病理特征、Keap1/Nrf2通路及预后的关系

邵坤 朱芳恒

乳腺癌居女性恶性肿瘤发病率第一位，严重威胁女性健康［1⁃2］。近些年，乳腺癌的诊疗技术取得了长足进步，手术切除联合放化疗、靶向治疗、内分泌治疗的综合治疗方案显著改善患者预后。尽管如此，仍有部分患者因为局部复发、远处转移而死亡，但目前乳腺癌复发、转移的调控机制尚不明确，临床上也缺乏能够有效预测乳腺癌预后的标志分子。微小RNA（microRNA，miR）是一族非编码小分子RNA，多种miRs 在恶性肿瘤的发病中起促癌或抑癌作用，是备受关注的恶性肿瘤标志物分子［3⁃5］。根据常景芝［6］的细胞实验研究结果，miR⁃141 靶向负调控KELCH 样ECH 关联蛋白1（Kelch Like ECH Associ⁃ated Protein 1，KEAP1），进而激活下游核因子E2 相关因子2（nuclear factor E2⁃related factor 2，Nrf2）、降低氧化应激水平并抑制乳腺癌细胞的活力。本研究将以乳腺癌患者为对象，观察乳腺癌中miR⁃141 表达与临床病理特征、Keap1/Nrf2通路及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2014年3月至2015年3月期间在本院接受手术治疗的乳腺癌患者142 例作为研究对象，年龄29～72 岁，平均（54.59±10.85）岁。入组标准：①接受乳腺癌根治术或改良根治术；②经术后病理诊断乳腺癌，病理类型为浸润性导管癌；③临床病理资料完整；④随访资料完整。排除标准：①术前进行放化疗、内分泌治疗；②发生远处转移；③既往有其他恶性肿瘤病史。本研究取得医院伦理委员会批准及患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 miR⁃141 表达的检测

取乳腺癌组织和癌旁组织，采用miR提取分离试剂盒（北京天根公司）分离组织中的miR，采用miR cDNA 第一链合成试剂盒（北京天根公司）将组织中的miRNA 反转录为cDNA，采用miR 荧光定量检测试剂盒对cDNA 中的miR⁃141 和U6 进行检测，配置PCR 反应体系如下：cDNA 2 μL、反应预混液10 μL、10 μmol/L 的上游引物和下游引物各0.6 μL、去离子水6.8 μL，在PCR 仪上按照95℃预变性3 min 后95℃5 s、60℃15 s 的程序反应40 个循环，得到循环曲线后以U6 为内参计算miR⁃141的表达量。

1.2.2 Keap1、Nrf2 表达的检测

取乳腺癌组织和癌旁组织各约20 mg，加入RIPA 裂解液（上海碧云天公司）后匀浆，匀浆液离心后得到蛋白样本，采用BCA 试剂盒（上海碧云天公司）检测蛋白浓度后取含有30 μg 蛋白的样本进行western blot 检测，将样本加入SDS⁃聚丙烯酰胺凝胶并进行电泳，而后电转移至PVDF 膜，5%脱脂牛奶室温封闭PVDF 膜1 h，4 ℃孵育Keap1（1∶1 000 稀释，Abcam 公司）、Nrf2 抗体（1∶2 000 稀释，Abcam 公司）、β⁃actin 抗体（1∶5 000 稀释，Sigma 公司）过夜；第二天，室温孵育HRP二抗（1∶2 000稀释，Abcam公司）1 h，在凝胶成像系统（上海天能公司）中曝光得到蛋白条带，根据条带灰度值计算Keap1、Nrf2的表达水平。

1.2.3 预后的随访

采用门诊或住院复查、电话回访的方式进行随访，随访截止日期2020年3月31日。总生存期指病理确诊日期至死亡日期或末次随访日期的时间，无病生存期指病理确诊日期至疾病出现进展的日期或末次随访日期的时间。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件进行统计处理，计量资料采用（）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，总生存期及无病生存期用Ka⁃plan⁃Meier 曲线描述、两组间比较采用log⁃rank 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 浸润性导管癌的HE 染色

浸润性导管癌的HE 染色见图1，具有典型的浸润性导管癌病理特征。

图1 浸润性导管癌的HE 染色图（×200）Figure 1 HE staining of invasive ductal carcinoma（×200）

2.2 乳腺癌组织及癌旁组织中miR⁃141表达的比较与癌旁组织（1.00±0.24）比较，乳腺癌组织（0.73±016）中miR⁃141 的表达水平明显降低，差异有统计学意义（t=11.154，P＜0.05）。

2.3 不同临床病理特征乳腺癌组织中miR⁃141 表达的比较

不同年龄、分子亚型、组织学分级的乳腺癌组织比较，miR⁃141 表达水平的差异无统计学意义（P＞0.05）；不同肿瘤直径、TNM 分期的乳腺癌组织比较，miR⁃141 表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 不同临床病理特征乳腺癌组织中miR⁃141 表达的比较（±s）Table 1 Comparison of miR⁃141 expression in breast cancer tissues with different clinicopathological features（±s）

表1 不同临床病理特征乳腺癌组织中miR⁃141 表达的比较（±s）Table 1 Comparison of miR⁃141 expression in breast cancer tissues with different clinicopathological features（±s）

临床病理特征年龄肿瘤直径TNM 分期分子亚型n t/F 值1.150 5.360 5.475 0.833 P 值0.252 0.000 0.000 0.285组织学分级分类＜50 岁≥50 岁＜2 cm≥2 cmⅠ～ⅡⅢLuminal A 型Luminal B 型HER⁃2 型三阴型1～2 3 88 54 74 68 94 48 12 68 28 34 104 38 miR⁃141 0.74±0.13 0.71±0.18 0.80±0.20 0.65±0.12 0.79±0.20 0.62±0.11 0.77±0.20 0.72±0.18 0.68±0.16 0.63±0.12 0.74±0.20 0.69±0.12 1.447 0.150

2.4 不同miR⁃141 表达水平的乳腺癌组织中Keap1、Nrf2 表达的比较

与miR⁃141 表达水平＜中位数的乳腺癌组织比较，miR⁃141 表达水平≥中位数的乳腺癌组织中Keap1 的表达水平明显降低、Nrf2 的表达水平明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2、表2。

图2 不同miR⁃141 表达水平的乳腺癌组织中Keap1、Nrf2的蛋白条带Figure 2 Protein bands of Keap1 and Nrf2 in breast cancer tissues with different miR⁃141 expression levels

表2 不同miR⁃141 表达水平的乳腺癌组织中Keap1、Nrf2 表达的比较（±s）Table 2 Comparison of Keap1 and Nrf2 expression in breast cancer tissues with different miR⁃141 expression levels（±s）

表2 不同miR⁃141 表达水平的乳腺癌组织中Keap1、Nrf2 表达的比较（±s）Table 2 Comparison of Keap1 and Nrf2 expression in breast cancer tissues with different miR⁃141 expression levels（±s）

miR⁃141 表达水平＜中位数≥中位数t 值P 值n 71 71 Keap1 0.73±0.20 0.33±0.09 15.358 0.000 Nrf2 0.46±0.08 0.81±0.24 11.658 0.000

2.5 不同miR⁃141表达水平的乳腺癌患者预后的比较

经log rank 检验：与miR⁃141 表达水平＜中位数的乳腺癌患者比较，miR⁃141 表达水平≥中位数的乳腺癌患者总生存期及无病生存期均明显延长（P＜0.05）。见图3。

图3 不同miR⁃141 表达水平的乳腺癌患者总生存期及无病生存期的Kaplan⁃Meier 曲线Figure 3 Kaplan Meier curve of overall survival disease free survival in breast cancer patients with different miR⁃141 expression levels

3 讨论

miR 是在恶性肿瘤发病中起重要生物学作用的非编码小分子RNA，其中miR⁃141 是一种已知的具有抑癌作用的miR［7］。国内常景芝的细胞实验发现，过表达miR⁃141 抑制乳腺癌细胞的活力［6］。除此之外，国外多项研究在其他恶性肿瘤细胞中证实了miR⁃141 的抑癌作用，Liang Z［8］、Zhao Y［9］、Zhao Z［10］的研究分别证实miR⁃141 对结直肠癌细胞、肝癌细胞、头颈部恶性肿瘤细胞的增殖具有抑制作用。本研究将在上述实验研究的基础上，在乳腺癌患者中探究miR⁃141 表达的变化及临床意义。

虽然近些年关于乳腺癌发病机制的研究不断深入，靶向治疗、内分泌治疗也在乳腺癌治疗中取得了积极价值，但乳腺癌患者仍不可避免出现复发和转移，整体预后并不理想。因此，寻找在乳腺癌发病及病理进程中起关键作用的分子，不仅能够为发现新的病情及预后评价标志物提供思路，还能够为阐明疾病发病机制、发现新的治疗靶点提供依据。本研究的分析发现：乳腺癌组织中miR⁃141 的表达水平低于癌旁组织，且随着肿瘤直径增加、TNM 分期增加，乳腺癌组织中miR⁃141 的表达水平进一步降低。以上结果表明miR⁃141 表达降低与乳腺癌的发生及病理特征恶化有关，可能的机制是miR⁃141 的低表达使其抑癌作用削弱，进而促进了乳腺癌的发生及病理进展。

根据常景芝的细胞实验结果，miR⁃141 发挥抑制乳腺癌活力的作用与调控Keap1/Nrf2 通路有关［6］。Keap1/Nrf2 通路的主要生物学功能是调控细胞氧化应激水平，Keap1 是抗氧化分子Nrf2 的上游抑制分子，通过抑制Nrf2 的表达及功能来降低细胞的抗氧化能力，进而使细胞内活性氧簇生成增多、氧化应激水平增加。在乳腺癌及其他恶性肿瘤的发病过程中，氧化应激处于相对较高的水平，Keap1 的表达增加、Nrf2 的表达减少［11⁃12］。本研究观察了miR⁃141 与Keap1/Nrf2 通路的关系，结果显示：miR⁃141 表达水平＜中位数的乳腺癌组织中Keap1 的表达水平增加、Nrf2 的表达水平降低，表明乳腺癌中低表达的miR⁃141 与Keap1 表达增加、Nrf2 表达降低有关，可能通过调控Keap1/Nrf2 通路参与乳腺癌的发生及病理进展。

miR⁃141 的抑癌作用已经在多种恶性肿瘤中得到证实，胃癌、胰腺癌、前列腺癌相关的临床研究证实，肿瘤病灶内低表达的miR⁃141 与预后不良有关［13⁃15］。本研究在发现乳腺癌中miR⁃141 表达降低后，进一步对患者的预后进行了随访，通过比较随访过程中总生存期及无病生存期的差异可知：与miR⁃141 表达水平＜中位数的乳腺癌患者比较，miR⁃141 表达水平≥中位数的乳腺癌患者总生存期及无病生存期均明显延长，表明乳腺癌中miR⁃141的低表达与生存期缩短、预后不良有关，与miR⁃141在其他恶性肿瘤中与预后相关的报道一致。

综上所述，乳腺癌中miR⁃141 表达降低与病理特征恶化、Keap1/Nrf2 通路改变、预后变差有关，未来miR⁃141 有望成为评估乳腺癌病情及预后新的标志物，也能为研究乳腺癌的发病机制、发现新的治疗靶点提供新思路。