AMP活化蛋白激酶在大鼠缺血缺氧性脑损伤中的作用

宋文英,王 臻,唐 浩,丁 慧

(陕西省人民医院麻醉科,西安 710068;*通讯作者,E-mail:DinHuSR@126.com)

缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是新生儿中枢神经系统受损的常见原因,是由围产期新生儿缺氧和窒息相关的多种因素引起的[1]。围产期HIBD可导致慢性残疾和急性死亡,并导致长期的神经行为障碍,例如癫痫、认知障碍和婴幼儿脑瘫,甚至新生儿死亡[2]。

AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是一种三聚体丝氨酸/苏氨酸激酶,由α催化(α1或α2)、β调节剂(β1或β2)和γ调节剂(γ1,γ2或γ3)亚基组成[3]。AMPK是细胞能量储备的主要传感器,例如葡萄糖缺乏、局部缺血、饥饿和氧化应激等一系列病理状况都会增加AMPK的活性[4]。当细胞面临能量应激时,AMPK可通过磷酸化激活,进行分解代谢/合成代谢途径调节以增加细胞ATP水平[5]。AMPK也是参与神经保护的重要因素,大量证据表明,增加神经元中的AMPK活性可以保护神经元免受各种伤害[6]。AMPK可以通过缺血预处理激活,并发挥有益作用[7]。已有研究证明AMPK介导caspase-3依赖性神经元凋亡,是缺血性损伤期间神经元死亡的主要机制之一[8],说明AMPK激活或抑制是治疗脑缺血的一种方法。

由于缺血缺氧性脑损伤的发病机制复杂,临床上没有有效的治疗方案,且缺少有效的治疗药物。因此,本研究的目的在于研究AMPK对缺血缺氧脑损伤作用的机制,为进一步研究开发安全有效的HI治疗方案和药剂的研制提供一些见解和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

甲醛(北京化学试剂公司,50406)、生理盐水(西安京西双鹤药业有限公司,170324 3A)、无水乙醇(天津市天力化学试剂有限公司,20180408)、TUNEL染液(德国Roche公司,11684817910)、30%丙烯酰胺/胺溶液(Arc-Bis)(双螺旋生物科技有限公司,L3202A)、兔抗AMPK多克隆抗体(美国Proteintech公司,20584-1-A)、抗p-AMPK多克隆抗体(美国Proteintech公司,20589-6-P)、5×蛋白上样缓冲液(北京康为世纪生物科技公司,L10406)、TTC染液(广州齐云生物技术有限公司,D025)、RIPA裂解缓冲液(北京沃凯生物科技有限公司,N653)、化学发光HRP底物(北京瑞尔欣德科技有限公司,34080)、compound C(Sigma-Aldrich Inc,AB120843)、Autophagy Assay试剂盒(abcam,ab139484)。

1.2 方法

1.2.1 缺血缺氧性脑损伤动物模型的构建和分组 由陕西省人民医院[许可证号:SYXK(陕)2016-006]提供健康的7日龄新生SD大鼠(雌雄各半),平均体质量为(14±1.51)g,采用母乳喂养。保持在自然光(12 h/12 h明暗循环)、18-22 ℃的温度和40%-70%的相对湿度环境下,且噪音保持在50 dB以下,小鼠自由饮水和进食。饲养3 d后将这些大鼠随机分为3组,即假手术组(sham组)、缺血缺氧脑损伤6 h模型组(HI6 h组)和缺血缺氧脑损伤12 h模型组(HI12 h组)。HI模型的建立使用改进的Rice等[9]的方法。大鼠腹膜内注射0.3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉,在颈部切开约0.5 cm的切口,仔细分离颈动脉用双结扎线将其永久结扎以阻断血液流动,采用4号针缝合切口,手术持续时间不超过5 min,以防止由于手术时间延长而导致的非手术因素对新生大鼠造成任何伤害。待大鼠完全苏醒后放入20 ℃恒温的密封50 ml低氧容器中。缺氧2 h后,将大鼠送回母亲进行母乳喂养。在模型组中如果大鼠表现出缓慢移动、稳定性差并且翻身困难则认为该模型的建立成功。在HI模型建立6 h时处死大鼠进行后续实验研究,即为HI6 h组;HI建模成功后12 h将大鼠处死进行后续实验,即为HI12 h组;假手术组的大鼠仅进行颈动脉分离,无结扎或缺氧。

1.2.2 TUNEL染色检测神经元细胞凋亡 各取3个组的大鼠脑组织用4 ℃的10%甲醛固定,然后进行脱水透明处理,再将其浸入60 ℃石蜡中2 h包埋,取出组织置于冰上,待完全冷却凝固后,放入-20 ℃冰箱冻硬置于切片机切片(5 μm),然后将切片于50 ℃水面上展开,捞片、干燥。将干燥后的切片进行脱蜡、复水等处理后,用蛋白酶K工作液30 ℃孵育20 min,然后用PBS清洗3-5次,每次5 min。将清洗好的切片置于TUNEL反应液中,37 ℃黑暗孵育1 h,再用PBS清洗3次,每次5 min。最后在切片中滴入适量DAPI,盖好盖玻片封片,室温放置10 min后于激光共聚焦显微镜下观察并统计阳性细胞数量。

1.2.3 脑含水量的检测 各取3个组的大鼠麻醉后置于冰上立即取脑,去除小脑,取损伤部分称湿重,然后将其至于100 ℃烘箱烘干24 h,直到干重到达恒重为止,称其干重。脑含水量的检测参照公式:脑含水量(%)=(脑湿重-脑干重)/脑湿重×100%。

1.2.4 脑梗死体积的检测 各取3个组的大鼠的脑组织,加入组织冷冻包埋剂(-20 ℃,15 min),切2 mm厚大脑冠状面切片,于37 ℃的2% TTC染液中孵育15 min,用10%甲醛溶液固定(pH7.4),过夜脱水,采用Image pro plus 5.1软件检测脑梗死体积。

1.2.5 蛋白质免疫印迹检测p-AMPK和AMPK蛋白的表达 各取3个组的大鼠的右半球大脑皮层并均质化,并通过RIPA裂解缓冲液提取总蛋白。采用8%-12% SDS-PAGE电泳上分离出具有等量蛋白质的不同样品,转移到硝酸纤维素膜上,并于含5% BSA和0.1% Tween 20的1×Tris缓冲盐(TBS)中(1×TBST)室温孵育2 h。将膜与抗p-AMPK的小鼠单克隆抗体(Thr172)(1∶600),AMPK(1∶800)一起孵育,然后用1×TBST洗涤;并与HRP偶联的二抗在室温下孵育2 h。洗涤后在室温下用化学发光HRP底物检测蛋白带5 h,然后将其暴露于X射线胶片(Fujifilm Inc.)。使用Quantity One软件4.6.2(Bio-Rad Laboratories Inc.)分析一抗结合的信号强度,并以上样对照GAPDH蛋白(1∶1 000)标准化条带。

1.2.6 AMPK抑制剂处理 将compound C(AMPK抑制剂)溶于注射用盐水中,compound C的剂量(20 mg/kg)和给药途径(腹膜内注射)参照McCullough等[10]的研究结果选择,在所用剂量下compound C不会显著影响大鼠的其他生理参数[10]。将相同剂量compound C分别注射到假手术组(sham+CC组)和建模成功后的HI6 h组(HI6 h+CC组)和HI12 h组(HI12 h+CC组)的大鼠,并做后续检测。

1.2.7 大鼠自噬细胞检测 用过量CO2处死大鼠,用无菌器械取出脑组织,放在盛有4 ml含Ca2+和Mg2+的平衡盐溶液(BSS)的无菌培养皿中。在显微镜下剥离脑膜,取下海马体,并置于新配制的0.25%胰酶BSS溶液中37 ℃孵育15 min。随后小心吸掉胰酶溶液,加入5 ml BSS,层流柜中室温放置5 min,重复此步骤3次。分离细胞并计数以确定细胞密度,再将细胞悬浮于poly-L-lysine处理的培养皿。2 h后,将盖玻片转移至含有单层神经胶质的培养皿中用于后续实验。

本实验使用Autophagy Assay试剂盒(ab139484)进行自噬细胞的检测,按照说明书步骤操作。首先用400 μl 1×Assay Buffer清洗细胞,弃上清后重悬细胞,并调节至细胞浓度为106个/ml,取200 μl细胞悬液至新得EP管中,加入20 μl绿色检测试剂(Green Detection Reagent)在37 ℃下孵育细胞,避光染色30 min。800g离心5 min后收集细胞,重悬细胞后滴1滴细胞悬液在玻璃载玻片上,并覆盖盖玻片,再用荧光显微镜进行核染色定量检测。

1.3 数据处理与分析

本实验获得的所有数据均采用SPSS20.0软件进行统计分析,数据表示为平均值±标准差。多组间比较采用单因素方差分析及LSD事后检验进行统计分析,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 缺血缺氧性脑损伤大鼠脑含水量和脑梗死体积指标变化

结果显示,缺血缺氧性脑损伤模型组大鼠中脑含水量显著高于sham组(P<0.05),其中HI12 h组大鼠中脑含水量虽然高于HI6 h组大鼠,但差异无统计学意义(P>0.05)。而通过对3组大鼠脑梗死体积的检测发现,HI6 h组和HI12 h组大鼠脑梗死体积显著大于sham组的大鼠脑梗死体积,且HI12 h组大鼠脑梗死体积显著大于HI6 h组大鼠脑梗死体积(P<0.05,见图1)。

2.2 缺血缺氧性脑损伤大鼠神经元细胞凋亡情况

通过TUNEL染色法检测了各组大鼠脑神经元的凋亡情况。结果表明,与sham组大鼠相比,HI6 h组和HI12 h组大鼠脑组织神经元凋亡数量显著增加,且随着缺血缺氧脑损伤时间的增长,其凋亡数量也相应增加(见图2)。

图2 TUNEL染色法检测大鼠脑神经元凋亡情况

2.3 缺血缺氧性脑损伤大鼠脑组织中p-AMPK和AMPK蛋白的表达

与sham组大鼠相比,HI6 h组的大鼠中p-AMPK/AMPK相对表达量升高(P<0.05);与HI6 h组大鼠相比,HI12 h组的大鼠中p-AMPK/AMPK相对表达量升高(P<0.01,见图3)。其结果表明缺血缺氧性脑损伤大鼠中AMPK被激活,且表达量显著上调。

与sham组比较,*P<0.05;与HI6 h组比较,#P<0.05

2.4 AMPK抑制剂处理对缺血缺氧性脑损伤大鼠p-AMPK/AMPK表达和脑梗死体积的影响

结果显示,与HI12 h组的大鼠相比,HI12 h+CC组大鼠p-AMPK/AMPK的相对表达量显著降低(P<0.01),大鼠的脑梗死体积显著变小(P<0.01,见图4)。这些结果表明,AMPK途径是缺血缺氧性脑损伤大鼠神经元的新型信号通路。

与HI12 h组比较,**P<0.01

2.5 AMPK抑制剂处理对大鼠自噬体形成的影响

结果显示,未使用AMPK抑制剂CC处理的大鼠中自噬体的数量显著高于使用了抑制剂CC处理的大鼠的自噬体的数量(见图5)。该结果表明AMPK可能对细胞自噬具有重要的调控作用。

图5 AMPK激活或抑制对HI大鼠自噬体形成的影响

3 讨论

缺血缺氧是由于脑血压急剧下降以及随后的氧气和葡萄糖供应中断而引起的脑损伤。缺血性损伤与各种类型的细胞应激有关,包括谷氨酸兴奋性中毒[11]、氧化/亚硝基应激[12]、细胞凋亡[13]和坏死[14]。

先前的研究表明,AMPK的激活能够诱导自噬,并随后激活心脏、肝脏、肾脏和肌肉组织抗缺血性损伤的保护作用[15],这在HI发展过程中具有重要的作用。然而,自噬在脑缺血发病机制中的作用仍存在争议和不确定性[16]。多项研究结果表明,中风发作而引起的自噬激活加剧了缺血性神经元损伤程度[17]。但是也有更多的研究结果表明,自噬在大脑中的预激活显著增强了对缺血性损伤的耐受性,在于自噬的激活促进了细胞能量的产生,并进一步导致缺血暴露期间的神经元细胞凋亡减少[18]。在本研究中,我们探究了HI激活AMPK后在大脑中诱导细胞的自噬作用。此外,我们还研究了缺血缺氧大鼠模型中AMPK依赖性自噬对神经保护的作用。研究结果表明,缺血缺氧性脑损伤大鼠的敏感区域激活了自噬途径的发生,适度的自噬对缺血缺氧具有保护作用,过度的自噬则会造成神经元的损伤。

本研究发现HI通过AMPK依赖性途径诱导自噬,随后导致缺血性脑含水量的增加和神经元细胞凋亡的加剧。AMP激活的蛋白激酶(AMPK)在调节全身细胞能量的稳态中起着至关重要的作用[19]。尽管有新的证据表明AMPK可以被缺血处理激活,并作为缺血性代谢适应的潜在介质发挥有益作用[20],但迄今为止,关于AMPK在缺血缺氧性脑损伤中的作用机制研究仍然有限。因此,本研究检测了磷酸化的p-AMPK蛋白的表达水平变化,结果表明随着HI的时间增加(6-12 h),其蛋白表达水平显著上调,这一结果与前人报道的结果一致,HI使AMPK激活并发挥重要作用。新的研究证据表明缺血会导致周围器官中AMPK的激活,在心脏中缺血预处理后p-AMPK/AMPK比例显著增加,这说明AMPK活性上调[21]。Peralta等[22]在肝脏中发现缺血预处理会导致AMPK活化,从而保护了肝脏免受缺血再灌注损伤。这些研究结果表明AMPK可能充当缺血性代谢适应的介体,介导缺血损伤在周围器官中下游保护性信号的传导。本研究中,我们发现HI上调了大鼠脑中的p-AMPK/AMPK的表达水平,该结果表明HI诱导了大脑AMPK的激活。

本研究还发现缺血缺氧性脑损伤(HI)诱导的AMPK激活会导致自噬的增强。同时,通过抑制AMPK可以完全消除这种现象,这表明HI以AMPK依赖性途径显著增强了脑细胞的自噬。与我们的研究结果一致,通过降血糖药二甲双胍激活AMPK可以增强大鼠脑细胞的自噬[23]。在来自糖尿病OVE26小鼠的心肌细胞中,AMPK的药理激活导致自噬激活,使糖尿病性心肌病发生率降低[24]。Pauly等[25]最近的一项研究表明,AICAR(一种AMPK激活剂)的使用导致患有杜氏肌营养不良症小鼠肌肉中自噬的增加。此外,Wang等[26]发现AMPK的激活导致肾脏肾小管细胞自噬活性的上调。AMPK可以通过多种信号通路激活自噬,AMPK激活可通过抑制mTOR(一种保守的Ser/Thr激酶,对自噬起负调节作用)来增强自噬作用[27]。AMPK激活大脑自噬的确切途径还有待在未来进一步研究。

本研究还发现AMPK介导的自噬对缺血缺氧性脑损伤大鼠的神经起到一定的保护作用,本研究结果显示HI诱导的梗死体积和神经元细胞凋亡可以通过抑制AMPK或自噬而实现完全逆转。这种保护机制可能是由于HI诱导的自噬可以通过降解细胞蛋白、脂质和糖原来恢复细胞内ATP和氨基酸,从而增加神经元对致死性缺血暴露的耐受性[28]。除了能促进细胞能量产生外,自噬还提供了一种通过去除功能异常的线粒体而有效利用这些底物的机制[29]。

总之,我们的研究结果表明缺血缺氧性脑损伤大鼠在AMPK介导的途径中诱导脑组织的自噬,并使神经功能缺损得到适当的缓解。说明AMPK的激活对缺血缺氧性脑损伤疾病的治疗具有重要意义,AMPK可能是缺血缺氧脑损伤引起的中风预防和治疗的潜在靶标。