Dectin-1/Syk信号通路介导脂多糖诱导的BV2细胞中的炎症反应

程 林,可 红

(1山东省立第三医院急诊科,济南 250000;2山东第一医科大学第三附属医院神经内一科;*通讯作者,E-mail:1508030056@qq.com)

近年来,神经系统疾病的发生率和死亡率越来越高。研究表明,炎症反应在许多神经疾病的发生发展中起着至关重要的作用[1]。神经系统疾病发生炎症反应时,机体主要通过神经元、内皮细胞、小胶质细胞和其他免疫细胞的介导产生免疫反应[2]。研究显示,抑制炎症反应可改善神经疾病动物模型的预后[3,4]。然而,神经系统疾病的发生发展过程中炎症反应产生的具体机制仍不明确。

树突状细胞相关C型凝集素1(Dectin-1)是免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)偶联的C型凝集素受体(CLR)。它可识别各种与危险因素相关的病原体,并通过招募其下游分子脾酪氨酸激酶(Syk)触发炎症信号[5]。据研究报道,引发炎症反应的免疫受体在神经系统炎症反应中发挥重要作用[6,7]。然而,尚未有研究证实脑损伤后免疫受体Dectin-1在神经炎症反应中的作用。

Syk参与多种细胞类型的信号转导,是机体炎症细胞中免疫受体信号传导的关键介质[8]。Syk抑制剂PIC可以缓解缺血再灌注后的组织损伤[9]。Dectin-1通过活化的ITAM招募Syk并使其激活发生磷酸化,随后调控下游炎症因子的产生。研究表明,巨噬细胞中Dectin-1和Syk参与了先天免疫反应的过程[10]。然而,Dectin-1/Syk信号通路是否参与中枢神经系统疾病中的神经炎症反应,目前尚未有研究报道。本研究探讨揭示Dectin-1/Syk信号通路在脂多糖(LPS)诱导的BV2细胞产生的神经炎症反应中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与LPS炎症模型建立

BV2细胞培养于完全DMEM培养基(含10%胎牛血清,1%双抗的DMEM培养基),按照106/ml的细胞密度接种到10 cm培养皿中,置于37 ℃,5% CO2培养箱中进行培养,当细胞生长密度为5×105/cm2时,更换培养基,同时加入LPS,使其最终工作浓度为1 μg/ml[11]。将细胞在正常条件下培养3,6,12,24 h,然后提取细胞蛋白质。

1.2 体外给药

将Dectin-1受体拮抗剂LAM(Sigma-Aldrich,Merck)用生理盐水稀释至10 mg/ml,Syk抑制剂PIC(Selleck Chemicals,Houston,TX,USA)用DMSO稀释至50 mmol/L。根据实验进行分组(每组3个重复,n=3):空白对照组(对照组)、LAM预处理对照组(对照+LAM组)、脂多糖(LPS)组、LAM预处理LPS组(LPS+LAM组)、PIC预处理对照组(对照+PIC组)和PIC预处理LPS组(LPS+PIC组)。在LPS诱导前,培养基中加入300 μg/ml LAM或25 μmol/L PIC预处理1 h。然后培养基中加入工作浓度为1 μg/ml的LPS孵育24 h,提取细胞蛋白。

1.3 Western blotting检测蛋白表达

按蛋白提取试剂盒说明书提取细胞蛋白样品,BCA法测定蛋白浓度。我们使用的一抗是Dectin-1抗体(1∶1 000,英国Abcam公司),Syk抗体(1∶1 000,美国CST公司),p-Syk抗体(1∶1 000,美国CST公司),TNF-α抗体(1∶1 000,美国CST公司)和iNOS抗体(1∶1 000,美国CST公司),GAPDH抗体(1∶1 000,美国CST公司)。根据一抗来源选择合适的二抗(1∶3 000,美国CST公司)。等量蛋白样品经10%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离后,采用湿转法将蛋白转移到硝酸纤维素(NC)膜上。用5%(50 g/L)脱脂奶粉封闭后,一抗孵育4 ℃过夜,二抗孵育2 h。使用辣根过氧化物酶显色法(ECL)将膜曝光显色。采用Image J软件测量条带的灰度值,以GAPDH为内参,检测蛋白的相对表达量(每组至少重复3次,并进行统计数据处理)。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 LPS诱导后BV2细胞中Dectin-1、Syk和p-Syk的蛋白表达增加

与对照组相比,LPS组中LPS诱导BV2细胞3,6,12,24 h时,Dectin-1、Syk和p-Syk的表达水平显著增加,差异有统计学意义(P<0.05,见图1),其中Dectin-1,Syk和p-Syk的表达水平在诱导24 h时升高最为明显,故选择LPS诱导24 h进行后续实验。

与对照组比较,*P<0.05

2.2 阻断Dectin-1可以抑制Dectin-1/Syk信号通路

与对照组相比,LPS组中Dectin-1和p-Syk的蛋白表达显著增多,差异有统计学意义(P<0.05);然而,与LPS组相比,LPS+LAM组Dectin-1和p-Syk蛋白表达水平降低(P<0.05)。与对照组相比,LPS组中TNF-α和iNOS表达量升高,差异有统计学意义(P<0.05);与LPS组相比,LPS+LAM组中TNF-α和iNOS的表达明显下调(P<0.05,见图2)。这些结果表明Dectin-1在神经炎症反应中发挥重要作用。

与对照组比较,*P<0.05;与LPS组比较,#P<0.05

2.3 PIC通过抑制LPS诱导的BV2细胞炎症中Dectin-1/Syk信号通路而减少TNF-α和iNOS的产生

与LPS组相比,LPS+PIC组BV2细胞中p-Syk蛋白表达显著减少(P<0.05),而且LPS诱导的BV2细胞中TNF-α和iNOS的表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。但LPS组和LPS+PIC组的Dectin-1表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05,见图3)。这些结果表明,Dectin-1/Syk信号通路在神经炎症反应中具有重要作用。

与对照组比较,*P<0.05;与LPS组比较,#P<0.05

3 讨论

Dectin-1是一种Ⅱ型跨膜受体,属于CLR家族,其胞外存在一个C型凝集素样结构域(CTLD),可以识别真菌细胞壁中具有的β-1,3葡聚糖碳水化合物[11]。有研究报道,Dectin-1在黏膜皮肤真菌感染或真菌诱导的肠道炎症中发挥重要作用[12],Dectin-1可以激活NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体,从而促进促炎因子IL-1β的产生[13]。此外,先前研究显示Dectin-1在正常脑组织中处于低表达水平或没有表达,但暴露于各种刺激(例如缺血和损伤)后其表达显著增加[7]。Dectin-1的活化还可引起巨噬细胞介导的脱髓鞘和轴突损伤,而阻断Dectin-1可减少脊髓损伤后巨噬细胞介导的神经损伤[14]。在本研究中,我们发现LPS诱导后BV2细胞中Dectin-1的蛋白表达显著增加,LAM预处理后Dectin-1的蛋白表达降低。这些数据表明,Dectin-1过表达可能对小胶质细胞产生有害影响,并增强TNF-α和iNOS诱导的神经炎症反应。

坏死细胞释放的危险相关分子模式(DAMPs)与Dectin-1结合,导致Syk的募集和活化[15]。活化的Syk(p-Syk)调控下游信号分子(如p85、pkb、pdk1和NF-κB)的表达与激活,导致促炎因子的表达,包括TNF-α、COX-2和iNOS[16]。Syk抑制剂PIC能降低视网膜缺血再灌注损伤后的神经元损伤。在本研究中,我们发现LPS诱导后BV2小胶质细胞中的Syk和p-Syk蛋白表达均增加。Syk抑制剂PIC预处理可减少LPS炎症模型中Syk、p-Syk、TNF-α和iNOS的表达。这些数据表明,Syk表达的增多可能对脑组织产生有害影响,并增强脑内的神经炎症反应。

神经炎症在神经系统疾病的脑损伤和修复中发挥重要作用。在神经细胞出现炎症反应期间,由于细胞缺氧和缺血导致细胞死亡,并引发危险相关分子模式的产生,随后激活驻留的神经胶质细胞。激活的神经胶质细胞释放一系列细胞因子和趋化因子,过多表达的促炎因子会加重细胞损伤[17]。本研究表明,LPS诱导后,可激活BV2小胶质细胞中的Dectin-1和Syk,使其蛋白表达量增加。Dectin-1通过激活Syk引发细胞内信号通路,导致促炎细胞因子TNF-α和iNOS的表达增多;Dectin-1和Syk抑制剂预处理,均可以降低p-Syk的表达,抑制LPS诱导后BV2小胶质细胞中的促炎因子TNF-α和iNOS的释放。总之,Dectin-1/Syk信号通路在LPS刺激的神经炎症反应中发挥着重要作用,进一步研究Dectin-1/Syk信号通路在神经炎症反应中的病理生理机制,可能为神经炎症相关临床疾病的治疗提供新的靶点。