葛根素减轻线粒体氧化应激改善大鼠心脏缺血再灌注损伤

杨竞霄,李菁华,李 炜,王芳芳,牛晓琳,王 静,陈蕊蕊,王子宽*

(1空军军医大学唐都医院心内科,西安 710038;2空军军医大学唐都医院超声科;3西安国际医学中心医院心内科;*通讯作者,E-mail:wangzikuan@sohu.com)

心肌梗死是一种严重危害人类健康的心血管疾病,也是导致患者死亡的重要原因[1]。自从Jenning等[2]在60年前首次提出再灌注损伤的概念后,研究人员已经对缺血再灌注损伤的机制有了非常深入的了解,最引人关注的主要包含离子通道障碍、氧化应激、炎症反应、钙超载和血管内皮功能障碍等[3-6]。缺血再灌注损伤的分子机制错综复杂,不同信号通路都一定程度地参与了损伤的形成。然而,受到各种原因的限制,基础研究并未能有效的转化为临床应用。因此,寻找潜在的临床治疗药物成为研究的重点。

葛根素(puerarin,Pue)是从葛根中提取的主要生物活性成分,化学名为8-β-D葡萄吡喃糖-4’,7-二羟基异黄酮[7]。在我国已被广泛应用于心脑血管疾病和糖尿病的治疗[8]。研究表明,Pue对心肌缺血再灌注损伤具有重要的保护作用,其主要作用表现为改善耗氧量、降低心肌梗死面积和改善心脏舒张功能等[7,9,10]。先前的研究进一步表明,这些保护作用可能与抑制线粒体渗透性转换孔(mPTP)开放、激活线粒体三磷酸腺苷(ATP)敏感钾通道开放、激活钙离子依赖的钾通道和激活蛋白激酶C等有关[11]。以往的许多研究都集中在Pue的药理学作用,Pue对心肌IR损伤的保护作用机制仍有待阐明。在心脏缺血再灌注损伤中,Pue对线粒体氧化应激和线粒体能量代谢的作用还不清楚,本实验采用大鼠离体心脏缺血再灌注模型,探讨Pue调控线粒体功能改善心脏缺血再灌注损伤的作用,这将为Pue成为临床治疗IR损伤的可能药物提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

从空军军医大学实验动物中心购买30只雄性成年SD大鼠,体质量在220-250 g之间;Pue和2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)购买于Sigma公司;在南京建成生物公司购买LDH、MDA、H2O2和ATP含量检测试剂盒以及SOD活性检测试剂盒。灌流液Krebs-Henseleit成分和含量如下:NaCl 120 mmol/L,KCl 4.7 mmol/L,NaHCO325 mmol/L,MgSO41.2 mmol/L,CaCl21.25 mmol/L,KH2PO41.2 mmol/L,Glucose 11 mmol/L,pH 7.4,用混合气体(体积分数95%O2/5%CO2)维持灌流液氧饱和度,并控制整个灌流过程中KH液温度恒定为37 ℃。

1.2 离体心脏灌流和实验分组

腹腔注射10%水合氯醛(10 ml/kg)将大鼠麻醉,同时腹腔注射肝素(500 U/kg),麻醉好后立即剪开胸腔暴露心脏,沿主动脉根部取下心脏并放入预冷的灌流液中,用结扎线快速固定在Langendorff灌流管口,打开三通阀使灌流液经主动脉根部逆行恒压80 mmHg灌注离体心脏。在左心耳处剪口,将带有球囊的导管在心脏处于舒张期时经二尖瓣插入左心室,导管与压力换能器连接并通过Labchart软件记录数据。通过调节球囊内液体体积使左心室舒张末压介于0-5 mmHg,等到心率和左室内压力稳定后根据实验要求随机分组。30只大鼠随机分成3组。正常对照组(control):灌流液正常灌注160 min;缺血再灌注组(IR):全心缺血40 min,恢复灌流液灌注120 min;Pue处理缺血再灌注组(Pue+IR):全心缺血40 min,用含10 μmol/L Pue的灌流液灌注5 min,灌流液正常灌注115 min。

1.3 TTC检测心肌梗死面积

灌流结束后,将心脏取下并冻存于-80 ℃冰箱30 min;等实验结束后,全部心脏均按照心尖向心底部方向连续切6片厚度均一的薄片,将切片放入12孔板中并加入预冷的2% TTC溶液,37 ℃避光水浴15 min;然后放入盛有10%多聚甲醛的离心管中室温浸泡2 d;将心脏切片按照一定顺序排列并用数码相机拍照,Image J软件分析梗死面积。红色区代表缺血心肌组织面积,白色区代表死亡心肌面积,心肌梗死面积百分比(%)=(梗死心肌面积/心肌总面积)×100%。

1.4 心脏功能的测定

实验全程用Labchart软件实时记录左心室内压力(left ventricular pressure,LVP),同时记录左心室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)和左心室收缩峰压(left ventricular peak systolic pressure,LVPSP)的数值。左室收缩和舒张功能分别用左室发展压(LVDP)的大小和LVEDP的数值反映,而LVDP的大小由LVPSP和LVEDP的差值计算得来。

1.5 HE染色

实验结束后,将心脏快速取下并放置于10%多聚甲醛溶液中固定,采用常规脱水复蜡步骤制备心脏蜡块,并切成薄片。行常规HE染色方法,光镜下观察各组心脏纤维形态。

1.6 检测冠脉流出液中LDH含量

根据南京建成生物公司提供的LDH的ELISA检测试剂盒说明书,采集再灌注前5 min内各组心脏冠脉流出液,按照试剂盒的步骤和要求采用酶标仪检测各组冠脉流出液中LDH的吸光值,并按照说明书将测量的LDH吸光值转换成U/L来表示。

1.7 线粒体MDA、H2O2含量、SOD活性和ATP含量的检测

剪取各组心脏左心室相同部位组织称重,采用常规组织蛋白裂解方法,并采用BCA蛋白定量法将各组蛋白浓度调平,分别根据检测线粒体MDA、H2O2含量、SOD活性和ATP含量的ELISA试剂盒步骤和要求,使用酶标仪测量各组心肌组织线粒体中MDA、H2O2含量、SOD活性和ATP含量。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠心肌梗死面积和冠脉流出液中LDH含量的比较

与control组比较,IR组心肌梗死面积和冠脉流出液中LDH含量均显著增加,差异有统计学意义(P<0.01);与IR组比较,Pue+IR组心肌梗死面积和冠脉流出液中LDH含量均显著减少,差异有统计学意义(P<0.01,见图1)。结果提示,Pue可减轻IR引起的心肌损伤。

与control组比,##P<0.01;与IR组相比,**P<0.01

2.2 各组大鼠心肌纤维形态的比较

control组心肌纤维形态清晰,排列整齐;IR组心肌纤维断裂明显,排列混乱,细胞核逸出;而与IR组比较,Pue+IR组心肌纤维断裂明显减轻,细胞核逸出减少(见图2)。结果提示,Pue可改善IR引起的心肌纤维排列紊乱,减轻纤维断裂。

图2 各组大鼠心肌纤维形态的比较(×400)

2.3 各组大鼠心肌细胞凋亡的比较

与control组比较,IR组TUNEL染色显示凋亡阳性细胞核明显增多,凋亡率增加,差异有统计学意义(P<0.01);与IR组比较,Pue+IR组TUNEL染色显示凋亡阳性细胞核明显减少,凋亡率降低,差异具有统计学意义(P<0.01,见图3)。结果提示,Pue可减轻IR引起的心肌细胞凋亡。

图3 各组大鼠细胞凋亡的比较

2.4 各组大鼠心脏功能的比较

与control组比较,IR组心脏LVDP明显降低,LVEDP显著抬升,差异具有统计学意义(P<0.01);与IR组比较,Pue+IR组心脏LVDP明显增加,LVEDP显著降低,差异有统计学意义(P<0.01,见图4)。结果提示,Pue可以改善IR引起的心脏功能障碍。

与control组比,##P<0.01;与IR组相比,**P<0.01

2.5 各组大鼠心肌线粒体氧化应激和ATP含量的比较

与control组比较,IR组线粒体MDA和H2O2含量显著增加,SOD活性和ATP含量明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.01);与IR组比较,Pue+IR组线粒体MDA和H2O2含量明显降低,SOD活性和ATP含量显著增加,差异均有统计学意义(P<0.01,见图5)。结果提示,Pue可减轻IR引起的线粒体氧化应激,增加ATP生成。

与control组比,##P<0.01;与IR组相比,**P<0.01

3 讨论

快速恢复缺血心肌的血液供应即再灌注是目前治疗缺血引起的心肌损伤的最佳策略,但值得注意的是,再灌注恢复血液供应的同时还会导致新的损伤,触发心律失常,甚至发展为心力衰竭[12]。因此,如何在恢复缺血心肌再灌注的同时减轻其引起的额外损伤,并寻找有效的临床治疗药物成为研究的重点和难点。

Pue是一种异黄酮类化合物,是豆科植物野葛根中提取的最主要的活性成分,因其具有明确的抗炎症、抗氧化应激、扩张冠状动脉血管、抗细胞凋亡等药理学作用,而被广泛应用于临床心血管疾病的治疗,而其作用机制在基础研究中也得到了广泛关注[13,14]。本研究发现,缺血后Pue处理可明显改善IR损伤,表现为心肌梗死面积减小、冠脉流出液中LDH含量和细胞凋亡率降低;同时HE染色发现Pue可以减轻IR引起的心肌纤维断裂。另外,心脏功能结果显示,IR后Pue处理可以显著提高左室收缩压,降低左室舒张压。以上这些结果进一步明确了Pue抗心肌缺血再灌注损伤的作用。然而,Pue抗心肌缺血再灌注损伤的作用与线粒体氧化应激的关系还不清楚。

心肌细胞内含有数量庞大的线粒体可以产生大量ATP满足其对能量的高度依赖,然而,缺血再灌注过程中出现的线粒体功能障碍加剧了心肌损伤,尤其是线粒体在能量代谢、ROS形成和凋亡启动等过程中发挥着重要作用[15-17]。MDA、H2O2和ROS在线粒体大量堆积,同时SOD活性被抑制,这会导致氧化-抗氧化系统平衡的破坏,形成氧化应激损伤。本研究结果发现,IR组MDA和H2O2含量明显增加,SOD活性降低,这说明氧化应激程度加重,同时,ATP含量明显降低;而Pue处理IR后,可明显降低MDA和H2O2含量,增加SOD活性,并提高ATP含量。这些结果证明Pue能够减轻线粒体氧化应激损伤,增加ATP含量。

综上所述,本实验从心肌梗死、心脏功能和细胞凋亡的角度进一步证实了Pue具有抗心肌缺血再灌注损伤的作用,并发现其是通过降低线粒体MDA和H2O2含量、增加SOD活性和ATP含量、抑制线粒体氧化应激损伤来发挥作用。这些实验结果为Pue成为临床上潜在的防治缺血再灌注损伤的药物提供了实验依据和理论支持。