低频超声联合5-FU对结肠癌HT-29细胞生物学特性的影响

李 艳,罗栩伟,朱冬梅,杨 姣,张英娟,张 慧,陈思佳,刘 刚,刘学彬*

(1南充市中心医院,川北医学院第二临床医学院超声科,南充 637000;2南充市中心医院,川北医学院第二临床医学院骨科；*通讯作者,E-mail:540677374@qq.com)

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是世界上第三大常见癌症,目前化疗仍然是结肠癌患者的一线治疗方法,但由于耐药性的产生,结肠癌易复发转移,死亡率仍然居高不下[1,2]。研究发现[3-5]肿瘤细胞中有一小群具有干性的细胞,在肿瘤异质性的形成和获得抗药性中起关键作用,被称为肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs),是影响结肠癌耐药性获得和复发转移过程的主要原因。因此,靶向结肠癌中的肿瘤干细胞是改善结肠癌患者的治疗疗效和生存期的关键。

声动力疗法(sonodynamic therapy,SDT)是一种新兴的抗肿瘤方法,近年来在癌症治疗中受到重视[6,7]。其中,低频超声(low-frequency ultrasound,LFUS)由于空化效应,可在细胞膜上形成小孔,增加大分子物质的摄取,也可诱导敏感细胞发生凋亡,同化疗药物联合使用,可以产生更好的协同抗肿瘤效果而受到研究者们的青睐[8,9]。在本研究中,我们假设LFUS对结肠癌细胞的刺激可以增强其对化疗药物治疗的敏感性,比较有无LFUS刺激的细胞增殖、凋亡差异以及CSCs集落的形态变化等。这将为结肠癌的治疗提供一种新的思路和治疗方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

人结肠细胞系HT-29(购自武汉中国细胞研究中心);无血清高糖细胞DMEM培养基(美国Hyclone公司);10 000 U/ml penicillin和10 000 μg/ml streptomycin(美国Hyclone公司);磷酸盐缓冲液(PBS)(美国Hyclone公司);胎牛血清(FBS)(美国Hyclone公司);0.25%胰酶(美国Hyclone公司);BCA蛋白定量试剂盒(Thermo Fisher);CCK-8试剂盒(中国江苏凯基生物科技股份有限公司);总RNA提取试剂盒(中国TIANGEN生化科技有限公司);细胞培养箱(美国Thermo公司);核酸扩增仪(美国Thermo公司);BIO-RAD实时荧光定量PCR仪(ICYCLER IQ5)(美国Bio-Rad公司);核酸微量分光光度计(德国Eppendorf公司);旋涡震荡器(德国Eppendorf公司);高低速离心机(美国Thermo公司);超声发生器(UP50H)(德国Hielscher)。

1.2 实验方法

1.2.1 人结肠癌的普通培养 人结肠癌HT-29细胞培养于DMEM完全培养液(含10%胎牛血清,100 U/ml青霉素,100 μg/ml链霉素)。将HT-29细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养,0.25%的胰酶消化细胞,隔2-3 d传代1次,取对数生长期的细胞进行肿瘤干细胞球的培养以及细胞增殖实验。

1.2.2 无血清悬浮培养法(serum-free medium,SFM)富集肿瘤干细胞 收集对数生长期的HT-29细胞,PBS洗涤两次除去血清,然后用无血清培养基DMEM/F12(Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)重悬细胞接种到超低黏附的6孔培养板中,培养3 d。DMEM/F12培养基中含非必需氨基酸,N2添加剂(Invitrogen公司),B27添加剂(Invitrogen公司),表皮生长因子(EGF)(20 ng/ml,Invitrogen公司)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,10 ng/ml,Invitrogen公司)。

1.2.3 低频超声刺激细胞 采用30 kHz的超声发生器(UP50H,Hielscher,Germany)连接超声探头(MS1,Hielscher,Germany)用于刺激细胞。将要进行低频超声刺激的培养板用封口胶四周封紧,固定在泡沫板上,使其能漂浮于水中,培养板底部完全暴露于超声环境中。将板在30 kHz、密度为1 W/cm2中连续超声1 min,温度控制在37 ℃。将要进行超声的细胞传在同一细胞培养板,非超声处理的细胞传在另外的培养板上。

1.2.4 CCK-8检测细胞活性 收集对数生长期的HT-29细胞,消化后制备HT-29细胞悬液,再以每孔1×103个/100 μl的细胞悬液接种于96孔板中,培养24 h后,检测处理前各组细胞活性,然后处理细胞。低频超声组:30 kHz,1 W/cm2×1 min超声处理,仅刺激一次;5-FU组:药物浓度为10 mg/ml培养24 h;联合组:叠加处理因素;对照组:不做处理。处理后24,48,72,96 h进行CCK-8检测。CCK-8检测细胞活性方法:加入10 μl CCK-8溶液到90 μl培养基中,置换到所需检测的各孔中,37 ℃孵育1 h,然后使用酶标仪测定450 nm波长处的各孔光吸收值。

1.2.5 低频超声和5-FU对CSCs的影响 为了评价和比较低频超声和5-FU对CSCs的影响,采用超低黏附6孔板培养CSCs,在集落形成3 d后,对照组仅换为新鲜的DMEM/F12培养基,不做其他处理;低频超声组,换液后将细胞暴露于LFUS刺激,每天刺激一次,连续2 d;5-氟尿嘧啶(5-FU)组,换入含5 μg/ml 5-FU的DMEM/F12培养基;联合组(低频超声+5-FU),叠加上述处理即换入含5 μg/ml 5-FU的DMEM/F12培养基,并且每天LFUS刺激一次,连续2 d。每组3个复孔,并进行独立实验3次。

1.2.6 荧光定量PCR技术检测基因表达水平 按照总RNA提取试剂盒说明书,提取处理后的肿瘤干细胞球的总RNA,经逆转录得到cDNA。应用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测各组细胞干性相关基因的mRNA表达水平。本研究用CD133、CD44和Sox2的表达水平来表征结肠癌肿瘤干细胞干性的变化。引物序列见表1,GAPDH为内参基因。反应条件为:95 ℃预热15 min;94 ℃变性15 s,55 ℃退火30 s,60 ℃延伸30 s,共35个循环。每个反应孔的荧光信号达到设定阈值时的循环数即为Ct值。对检测得到的Ct值以相对定量的方法进行数据分析:miRNA的相对表达量用2-ΔΔCt来计算。每个基因重复反应3次,进行独立实验3次。

表1 引物序列

1.2.7 蛋白印迹(Western-blotting)检测蛋白表达情况 经过处理后的肿瘤干细胞转移至离心管,2 000 r/min离心5 min,收集细胞沉淀,加入细胞裂解液提取蛋白样品,BCA蛋白定量试剂盒进行定量。取等量蛋白样品进行10%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后,转移至醋酸纤维膜(NC)上,5%脱脂奶粉常温封闭1 h,加一抗4 ℃过夜,洗膜后加二抗孵育1 h。一抗(均购自美国Abcam公司)包括:鼠抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH,1∶2 000),兔抗人PARP(1∶100),兔抗人Bcl-2(1∶1 000),兔抗人CD133(1∶1 000),兔抗人CD44(1∶1 000)。常规增强化学发光法曝光、扫描成像。

1.2.8 统计学分析 使用SPSS 17.0统计学软件进行,计量资料以均数±标准差的方法表示,两组间采用t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析以及SNK检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 低频超声联合5-FU抑制结肠癌细胞的增殖

经低频超声和5-FU联合处理后,结肠癌细胞变圆、皱缩、丧失细胞形态,与对照组相比有明显差异(见图1A)。CCK-8检测结果显示,与对照组和单独处理组比较,低频超声和5-FU联合处理组细胞增殖明显受到抑制,差异具有统计学意义(P<0.05,见图1B)。

图1 低频超声和5-FU抑制HT-29细胞增殖

2.2 低频超声联合5-FU抑制结肠癌干细胞的克隆形成

与control组比较,LFUS组、5-FU组干细胞球数量差异没有统计学意义。与control组相比,LFUS和5-FU联合处理组干细胞球体松散,且个体小,数量显著减少,差异有统计学意义(P<0.05,见图2A)。提取处理48 h的干细胞球总RNA和蛋白,通过qRT-PCR和Western blot检测干性相关基因CD133、CD44和Sox2的mRNA水平和蛋白表达水平,结果表明与control组比较,LFUS和5-FU联合处理后干细胞球的干性CD133、CD44和Sox2的mRNA水平下调,同时检测到CD133、CD44蛋白表达水平也降低(见图2B和2C)。因此,我们认为低频超声联合5-FU能明显抑制结肠癌干细胞的克隆形成。

图2 低频超声、5-FU以及联合组对HT-29 CSCs形成的影响

2.3 低频超声促进5-FU诱导结肠癌干细胞凋亡

将经过处理的CSCs细胞用Acctuase酶(Sigma公司)消化成单个细胞后进行凋亡检测,对照组的凋亡率为(4.38±1.27)%,低频超声组的凋亡率为(4.45±1.56)%,5-FU组的凋亡率为(8.2±1.76)%,联合组的凋亡率为(12.27±1.63)%。低频超声组和5-FU组细胞凋亡率与对照组相比,差异没有统计学意义;与对照组和单独应用低频超声组相比,LFUS和5-FU联合组凋亡率显著增加,且差异具有统计学意义(P<0.05,见图3)。进一步Western blot检测结果显示,与对照组和低频超声组相比,LFUS和5-FU联合组凋亡蛋白PARP(poly ADP-ribose polymerase)裂解片段(cleaved-PARP)明显增加,同时BCL蛋白家族中的抑凋亡蛋白Bcl-2表达下调(见图4)。以上结果提示,低频超声可促进5-FU诱导结肠癌干细胞发生凋亡。

左下象限(Q4)显示活细胞,呈现Annexin Ⅴ-/PI-;右下象限(Q3)为早期凋亡细胞,呈现Annexin Ⅴ+/PI-;右上象限(Q2)为晚期凋亡细胞,呈现Annexin Ⅴ+/PI+;左上象限(Q1)为坏死细胞,呈现Annexin Ⅴ-/PI+

图4 Western bolt检测凋亡相关蛋白的表达情况

3 讨论

近年来,超声被报道为最好的药物释放触发技术之一,在肿瘤治疗研究中凸显光芒,这是因为它是一种低成本的非侵入性技术,可以精确地作用于肿瘤组织[10,11]。超声的治疗作用分为热疗和非热疗,其中由低频超声产生的非热空化机械效应具有穿透力强、组织损伤小、对恶性肿瘤细胞敏感等优点,因此低频超声在肿瘤治疗中具有明显优势[12,13]。LFUS可以提高化疗药物的抗癌活性,包括阿霉素[14]、顺铂[15]、5-氟尿嘧啶[16]、环磷酰胺[17]和多西紫杉醇[18],可能的机制是通过超声波的空化作用,形成声致孔现象改变了细胞膜和组织膜的通透性。并且,研究表明[19,20]低频超声能够提高包封后的肿瘤靶向药物在肿瘤的局部浓度,从而抑制肿瘤细胞耐药,提高疗效。

化疗是结肠癌患者的一线治疗方案,如5-FU可以杀伤普通的肿瘤细胞,但是肿瘤干细胞对化疗药却不敏感,这也是导致治疗失败的关键因素[21]。肿瘤干细胞和正常干细胞一样具有自我更新的能力,对常规化疗和放射治疗具有抵抗力,在促使肿瘤复发和远处转移过程中起主要作用[22,23]。Oct4和Sox2是常见的干细胞相关蛋白,并且Oct4和Sox2蛋白在CSCs中的表达高于正常癌细胞群体。研究表明[24],CD133和CD44在结肠癌干细胞中高表达。因此,本研究用CD133、CD44和Sox2的表达水平来表征结肠癌肿瘤干细胞的干性的变化。促进CSCs向正常的癌细胞转化,以消除其自我更新能力、增强CSCs对化学药物敏感性,是近年抗肿瘤治疗研究的热点之一[25-27]。本项研究联合低频超声和5-FU用于抗结肠癌,结果表明低频超声可以显著增强5-FU抗结肠癌细胞活性,使结肠癌HT-29细胞变圆、皱缩、丧失细胞形态。有趣的是,我们观察到LFUS和5-FU联合处理组干细胞球体松散,且个体小,数量显著减少,qRT-PCR和Western blot结果提示LFUS和5-FU联合处理可显著降低结肠癌干细胞的干性基因CD133、CD44和Sox2的表达水平。

肿瘤细胞受相关致癌基因的调控常常表现出抗凋亡的性质,影响细胞的正常代谢更新。研究者们[28]通过研究抗肿瘤疗法/药物是否能够抑制甚至逆转肿瘤细胞的抗调亡能力或者诱导肿瘤细胞的调亡来评估该疗法/药物在临床中的应用前景。PARP是细胞凋亡核心成员半胱天冬酶(Caspase)的切割底物,对于细胞的稳定和存活非常重要,PARP失去酶活力会加速细胞的不稳定。另外,Bcl-2蛋白是Bcl-2原癌基因的编码产物,Bcl-2能够阻止细胞色素C从线粒体释放到细胞质,从而抑制了细胞凋亡。通常,PARP剪切以及Bcl-2表达下调被认为是细胞凋亡的重要指标[29]。

本研究进一步经过流式细胞仪检测发现经联合处理的结肠癌干细胞凋亡率显著增加,同时凋亡相关蛋白PARP和Bcl-2也出现了凋亡相应的变化,那么表明低频超声可以明显增强5-FU诱导的结肠癌干细胞凋亡。但是本研究未对LFUS诱导细胞凋亡和影响肿瘤干细胞克隆形成能力降低的分子机制进行详细的研究,LFUS的刺激是否抑制CSCs的自我更新能力并诱导肿瘤干细胞分化为普通癌细胞而增强了对5-FU的敏感性还需要进一步研究。值得指出的是,肿瘤干细胞的自我更新能力在肿瘤干细胞克隆形成、肿瘤侵袭转移过程中起着重要作用,那么未来降低肿瘤干细胞的干性和侵袭能力,并增强其对化疗药物治疗的敏感性,阻断参与肿瘤干细胞自我更新和维持的通路对于抗肿瘤治疗至关重要。

4 结论

综上所述,本研究结果表明低频超声联合5-FU可以显著抑制结肠癌细胞活性,降低结肠癌干细胞的干性并促进其凋亡,从而增强结肠癌细胞对化疗药物的敏感性,这为结肠癌的临床治疗提供了另一种思路,也为低频超声联合低剂量的化疗药进行抗肿瘤治疗奠定研究基础。