PD-1/PD-L1通过抑制穿孔素和颗粒酶的极化抑制Vδ2T细胞对结直肠癌细胞的杀伤作用

李启凤,李一凡,张金芳,王开昕

(1华中科技大学协和深圳医院,深圳市南山区人民医院病理科,深圳 518000;2华中科技大学协和深圳医院,深圳市南山区人民医院中心实验室)

结直肠癌是全球仅次于肺癌和乳腺癌的第三大常见癌症。据2018年全球统计数据显示,全球2018年新发结直肠癌患者数占全球癌症新发患者的10.2%,位居新发癌症人数的第三位。结直肠癌死亡人数占全球癌症死亡患者的9.2%,位居癌症死亡人数的第二位[1]。结直肠癌的发生是一个复杂且异质性的过程,由多种发病因素相互作用引起,包括遗传因素和环境因素,如饮食和生活方式等[2]。结直肠癌现有治疗包括早期阶段的手术治疗,然后晚期患者需联合化疗和/或放疗,给患者带来严重的副作用[3]。

程序性细胞死亡分子-1(programmed cell death-1,PD-1)是一种免疫负调节分子,通过与其配体PD-L1的相互作用,对机体的免疫功能发挥抑制作用。PD-1/PD-L1分子在多种癌症的发生和发展中具有重要的作用[4-8]。研究证实,肿瘤细胞及其相关的基质细胞可以表达PD-L1,这种PD-L1通过与肿瘤杀伤T细胞表面PD-1相互作用,不仅引起肿瘤细胞的免疫逃逸,还导致活化的T细胞凋亡,因此阻断PD-1/PD-L1可以增加免疫细胞的抗肿瘤活性。目前,多种针对PD-1的单克隆抗体已被研发用于包括肺癌、肝癌和乳腺癌的治疗[9-11]。既往研究表明,PD-L1在转移性结直肠癌中的表达水平比在原发性肿瘤中普遍更高。近些年,PD-1/PD-L1也被确定为结直肠癌免疫治疗的可能靶点[12]。

结直肠癌患者体内的杀伤性细胞除外传统CD8 T细胞,Vδ2T细胞也是具有肿瘤杀伤活性的细胞[13]。Vδ2T细胞识别肿瘤相关抗原不具有MHC限制性,是一种天然免疫细胞。Vδ2T细胞的主要作用包括参与机体对肿瘤的免疫监视和对病原体侵袭的防御反应[14,15]。随着30年前第一次提出Vδ2T细胞的概念[15],到目前随着对Vδ2T细胞研究的深入,其已被证实对多种肿瘤细胞具有杀伤作用,是最具潜力的肿瘤过继免疫治疗细胞之一。然而目前,关于PD-1/PD-L1对Vδ2T细胞杀伤结直肠癌细胞的抑制作用及相关机制的探索目前还很少有研究报道。本文观察了健康志愿者外周血扩增Vδ2T细胞对结直肠癌细胞的杀伤情况,探讨PD-1对Vδ2T细胞杀伤功能的影响及相关机制,期望为未来结直肠癌患者PD-1单克隆抗体的免疫疗法或Vδ2T细胞过继免疫疗法的应用提供一些科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

1.2 Vδ2T细胞扩增

为了扩增人Vδ2T细胞,首先使用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法从健康成人外周血分离获取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。PBMC培养于含10% FBS和0.5 mmol/L唑来膦酸盐的RPMI-1640培养基中。48 h后向培养基中加入重组人IL-2(终浓度50 IU/ml),并每3 d补充一次重组人IL-2。待培养至第14天时收集扩增的Vδ2T细胞,采用流式细胞仪分析纯度,纯度达到90%以上可用于后续实验。

1.3 Vδ2T细胞杀伤功能检测

1.4 结直肠癌细胞表面分子检测

通过流式细胞术检测结直肠癌细胞表面与Vδ2T细胞活化相关的配体和共刺激分子表达情况(ULBP-1-4、MICA、MICB、MSH2),以及活化抑制分子的表达情况(TIM-3、CTLA-4和PD-L1)。具体方法如下:HR8348和SW480细胞以台盼蓝染色计数后制备成浓度为2×106个/ml的细胞悬液。取100 μl上述细胞加入1.5 ml的eppendorf管中,加入1 ml含1% BSA的PBS洗涤液,充分混匀后250g离心8 min,弃上清,重复上述操作。随后细胞以100 μl含1%BSA的PBS重悬,于液体中加入相应抗体,4 ℃避光孵育30 min;以含1%BSA的PBS洗涤2次后,细胞重悬于0.1 ml PBS中进行流式细胞仪检测。

1.5 PD-L1阻断

将SW480细胞分为两组,一组为PD-L1阻断组:加入97 μl PBS+3 μl PD-L1抗体;另一组为对照组:加入100 μl PBS。将两组细胞分别与Vδ2T细胞共培养,用于后续研究。

1.6 Vδ2T细胞裂解性颗粒极化情况检测

已知裂解性颗粒极化在Vδ2T细胞杀伤肿瘤细胞中具有重要的作用。本研究将通过Confocal方法检测Vδ2T细胞裂解性颗粒极化情况。具体方法如下:将Vδ2T细胞和结直肠癌细胞SW480悬液稀释至1×107cells/ml。取上述细胞各100 μl混匀,20g离心3 min使细胞可以充分接触;离心后的细胞置于37 ℃,5% CO2孵箱中孵育20 min;随后将细胞转入poly-D-lysine包被的2孔细胞培养板(购自BD Biosciences)中,室温孵育1 h;以无菌吸管吸去培养基,再用1 ml PBS洗2次;4%多聚甲醛1 ml室温固定20 min;再用1 ml PBS洗2次;0.5 ml透化Buffer室温处理细胞30 min;加入含3 μg/ml穿孔素抗体的染色Buffer室温染色1 h;1 ml PBS洗3次,每次5 min;将片子于空气中吹干;ProLong Gold Antifade Reagent封片。

1.7 PLC-γ1和Erk1/2信号通路活化情况检测

通过Western blot方法检测Vδ2T细胞内与裂解性颗粒极化相关信号通路的表达情况。具体方法如下:等量提取的Vδ2T细胞总蛋白经10% SDS-PAGE分离胶和5%浓缩胶分离后,采用半干转膜仪将蛋白转印至硝酸纤维素膜上,以含5% BSA的TBST室温封闭1 h,加入pY783-PLC-γ1(1∶1 000)和p-Erk1/2抗体(1∶1 000),4 ℃过夜孵育。第2天用0.1% TBST洗膜3次,每次5 min,加入相应的HRP标记的二抗,室温孵育1 h。0.1% TBST洗膜后,硝酸纤维素膜以Supersignal West Femto/Pico HRP敏感化学发光底物对条带进行显色。actin作为内参对照。所有实验至少重复3次。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 Vδ2T细胞对结直肠癌细胞具有杀伤作用

杀伤结果显示,Vδ2T细胞对结直肠癌细胞HR8348和SW480的杀伤效率存在差异(见图1)。Vδ2T细胞对SW480细胞没有显著的杀伤作用,而对HR8348细胞的有一定的杀伤作用。

与效靶比为10∶1相比,*P<0.05,**P<0.01

2.2 结直肠癌细胞表面Vδ2T细胞功能活化和抑制相关分子的比较

流式细胞染色结果显示,Vδ2T细胞活化配体和共刺激分子ULBP-1-4、MICA、MICB和MSH2在HR8348和SW480细胞的表达并不存在显著差异(见图2)。HR8348和SW480细胞表面Vδ2T细胞活化抑制分子的表达检测结果显示HR8348和SW480细胞表面表达CTLA-4和TIM-3并不存在显著差异;而二者的PD-L1表达水平存在显著差异,SW480细胞具有显著更高的PD-L1表达水平(P<0.01,见图2)。

灰色实体峰为同型对照抗体染色结果,红线峰为HR8348细胞染色结果,蓝线峰为SW480细胞染色结果;与HR8348细胞相比,**P<0.01

2.3 阻断PD-L1后Vδ2T细胞对结直肠癌细胞的细胞毒作用

采用PD-L1封闭抗体封闭SW480细胞表面PD-L1后,结果显示Vδ2T细胞对SW480细胞的杀伤能力显著增强(P<0.01)。同时,封闭HR8348表面PD-L1作用后,Vδ2T细胞HR8348细胞的杀伤能力也出现明显升高(P<0.01,见图3)。

与对照组相比,**P<0.01

2.4 阻断PD-L1后Vδ2T细胞裂解性颗粒极化情况

Confocal结果显示,在阻断PD-L1后SW480细胞引起Vδ2T细胞裂解性颗粒极化的水平显著升高(P<0.01,见图4)。

图4 阻断PD-L1后Vδ2T细胞裂解性颗粒极化情况

2.5 阻断PD-L1后Vδ2T细胞裂解性颗粒极化相关信号通路活化情况

Vδ2T细胞裂解性颗粒极化相关信号通路包括PLC-γ1和Erk1/2。本研究通过Western blot方法检测在阻断PD-L1后SW480细胞引起Vδ2T细胞PLC-γ1和Erk1/2磷酸化活化的情况。以阻断开始时的对照组相对荧光强度为1,计算各组相对荧光强度,结果显示,阻断PD-L1后的5 min和10 min,SW480细胞引起Vδ2T细胞PLC-γ1和Erk1/2磷酸化活化的水平显著升高(P<0.01，见图5)。

同时间与对照组相比,**P<0.01

3 讨论

恶性肿瘤通过激活免疫检查点从而创造免疫抑制的肿瘤微环境。在所研究的免疫检查点中,程序性细胞死亡分子-1(programmed cell death-1,PD-1)和PD-1的配体(PD-L1)是目前的研究热点。PD-1和PD-L1之间的特异性结合可抑制T细胞产生IL-2,并诱导T凋亡增加[16]。因此阻断PD-1/PD-L1可以增加免疫细胞的抗肿瘤活性。多种针对PD-1的单克隆抗体已被研发用于包括肺癌、肝癌和乳腺癌的治疗[9-11]。目前,PD-1抑制剂在多种肿瘤的治疗以联合治疗为主,单独的PD-1抑制剂疗效有限。临床可用的联合治疗包括化疗、放疗或是小分子抑制剂等[17-19]。肿瘤过继免疫治疗目前也处于研发状态,主要是把致敏淋巴细胞(具有特异免疫力的)或致敏淋巴细胞的产物(例如转移因子和免疫核糖核酸等)输给肿瘤病人,使其获得抗肿瘤免疫力。既然PD-1抑制剂的主要作用是解除杀伤性T细胞的免疫抑制,在此基础上如联合过继免疫治疗从理论上来说是可以进一步增加抗肿瘤活性的,但是目前临床还未见研究进展。本研究从理论基础上对PD-1抑制Vδ2T细胞杀伤功能及相关机制进行研究,期望可以为未来结直肠癌患者PD-1单克隆抗体的免疫疗法或Vδ2T细胞过继免疫疗法的应用提供一些科学依据。

本研究结果显示,Vδ2T细胞对结直肠癌细胞HR8348和SW480细胞的杀伤效率存在差异。Vδ2T细胞对SW480细胞的杀伤作用很微弱,而对HR8348细胞有较强的杀伤作用。流式细胞术结果显示,HR 8348和SW480细胞表面表达的和Vδ2T细胞活化相关的配体,包括ULBP-1-4、MICA、MICB和MSH2在HR8348和SW480细胞的表达并不存在显著差异;此外,HR8348和SW480细胞表面表达的Vδ2T细胞活化抑制分子CTLA-4和TIM-3也并不存在显著差异;而二者的PD-L1表达水平存在显著差异,SW480细胞具有显著更高的PD-L1表达水平(P<0.01)。提示,PD-L1表达水平的差异可能是Vδ2T细胞对HR8348和SW480细胞的杀伤效率存在差异的原因。

本研究进一步对PD-L1对Vδ2 T细胞杀伤功能的抑制作用进行验证。封闭PD-L1作用后,Vδ2 T细胞对SW480细胞的杀伤能力显著增强(P<0.01)。同时,封闭HR8348表面PD-L1作用后,Vδ2 T细胞HR8348细胞的杀伤能力也出现明显升高(P<0.01)。初步提示,PD-1和PD-L1的相互作用是抑制Vδ2 T细胞对结直肠癌细胞杀伤的主要原因。同时本研究还发现在封闭SW480细胞表面PD-L1后,Vδ2T细胞裂解性颗粒的极化能力显著提高。已知Vδ2T细胞的杀伤功能主要依赖于穿孔素-颗粒酶途径,且主要受裂解性颗粒极化的影响[21]。上述结果初步提示PD-1和PD-L1抑制Vδ2T细胞对结直肠癌细胞杀伤功能主要是通过抑制Vδ2T细胞穿孔素-颗粒酶极化而发挥的。已知杀伤性细胞裂解性颗粒极化与PLC-γ1和Erk1/2磷酸化水平相关[20,21]。本研究发现,封闭SW480细胞表面PD-L1后,Vδ2T细胞内与裂解性颗粒极化相关的PLC-γ1和Erk1/2磷酸化水平均显著增强(P<0.01)。

综上所述,本研究初步证实,Vδ2T细胞对不同结直肠癌细胞的杀伤作用是存在差异的,这种差异主要是肿瘤细胞表面PD-L1分子表达的不同所引起的;进一步的机制研究表明,PD-1抑制Vδ2T细胞的杀伤作用主要通过抑制裂解性颗粒极化及PLC-γ1和Erk1/2磷酸化活化而实现,为阐明PD-1抑制Vδ2T细胞杀伤结直肠癌细胞的作用机制提供了一定的证据支持。