转化生长因子β1和α平滑肌肌动蛋白在肝内胆管癌血管形成中的作用

李羿兴,艾麦提·牙森,马文梅,马明福*

(1新疆医科大学第一附属医院病理科,乌鲁木齐 830054;2新疆医科大学第一临床学院;*通讯作者,E-mail:63319431@qq.com)

胆管癌是一种起源于胆管上皮的恶性肿瘤,约占消化道肿瘤的3%,根据解剖学部位可分为肝内胆管癌和肝外胆管癌[1]。胆管癌起病隐匿,早期症状不明显,就诊时多已属晚期。手术切除仍然是最有效的治疗方法,但目前根治性切除率相对较低,对放化疗均不敏感,预后较差,故早发现和早诊治已成为临床面临的难题[2]。

胆管癌是一个多因素、多阶段的演变过程,其发生、发展不仅仅取决于多种癌基因的激活及抑癌基因的失活,肿瘤的微环境包括成纤维细胞等间质细胞、细胞外基质和细胞因子在肿瘤新生血管形成过程中起关键作用[3,4]。转化生长因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)作为一种多功能的细胞因子,可调节细胞的增殖、凋亡、分化及细胞外基质的产生,与肿瘤微环境中信号传导通路异常密切相关[5]。此外,肿瘤间质中的成纤维细胞在肿瘤分泌的多种因子刺激下被激活并表达α平滑肌肌动蛋白(α smooth muscle actin,α-SMA)促进肿瘤新生血管形成[6,7]。目前尚无TGF-β1、α-SMA与肝内胆管癌血管形成相关的研究,故本研究通过免疫组化和qRT-PCR检测肝内胆管癌组织中α-SMA、CK19、TGF-β1及CD31的表达,初步探讨TGF-β1和α-SMA在肝内胆管癌血管形成中的作用,为肝内胆管癌的诊治开拓新靶点。

1 材料与方法

1.1 临床标本

收集2018年12月至2020年5月新疆医科大学第一附属医院肝胆包虫科经手术切除且病理证实的50例肝内胆管癌患者癌组织和远端正常肝组织(离病灶中心5 cm以上)。所有患者均未接受放疗、化疗,临床资料完整,术后病理分型均为腺癌。按照国际抗癌协会(UICC)提出TNM分期标准,Ⅰ期25例,Ⅱ期14例,Ⅲ期11例;有淋巴结转移11例(22%),无淋巴结转移39例(78%)。男性32例(64%),女性18例(36%),年龄41-77岁,平均61岁。本研究获得我院伦理委员会批准,所有患者均已签署知情同意书。将上述组织标本置于4%的多聚甲醛溶液固定48 h,常规脱水,经石蜡包埋后,切厚为4 μm薄片备用。

1.2 主要试剂

兔多克隆抗体α-SMA、CD31、CK19、TGF-β1,辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗及DAB显色液(购自英国Abcam公司);天狼星红染色试剂盒(购自中国Solarbio公司);PBS缓冲液、山羊血清封闭液、柠檬酸钠抗原修复液及中性树胶(购自中国中杉金桥生物技术有限公司);Trizole、RNA逆转录试剂盒、SYBR(购自大连TaKaRa公司)。

1.3 苏木素&伊红(HE)染色

将薄片放入62 ℃烤箱烤烘60 min后常规脱蜡,放入蒸馏水浸洗3次×5 min,随后浸泡苏木素溶液1.5-2 min,立即蒸馏水冲洗至泛色,用盐酸乙醇分化2-5 s,再放入蒸馏水反蓝40-60 s后浸泡伊红溶液1-1.5 min,蒸馏水反复冲洗至泛色,常规脱水,透明并晾干,中性树胶封片后光学显微镜下观察并收集图像。

1.4 天狼猩红染色

将薄片放入62 ℃烤箱烤烘60 min后常规脱蜡;滴加天狼星红染液置于37 ℃ 30 min,用无水乙醇分化2-3 s后常规脱水,透明,中性树胶封固,在显微镜下观察并采图。使用ImageJ软件计算阳性区域面积进行统计分析。

1.5 免疫组化染色

将薄片放入62 ℃烤箱烤烘60 min后常规脱蜡,用蒸馏水冲洗3次×5 min,泡在枸橼酸抗原修复液高温(90-100 ℃)修复15 min,自然冷却至室温。PBS缓冲液冲洗3次×5 min,置于3% H2O2溶液室温孵育10 min,PBS缓冲液冲洗3次×5 min,滴加山羊血清室温封闭1 h后滴加一抗(α-SMA 1∶500;CD31 1∶50;CK19 1∶200;TGF-β1 1∶80)置于4 ℃冰箱孵育过夜。次日复温1 h后,PBS缓冲液洗3次×5 min,滴加二抗(1∶1 000)室温孵育90 min;PBS缓冲溶液冲洗3次×5 min后滴加适量DAB显色液于光学显微镜下观察显色。苏木精复染10-30 s,反复冲洗至泛色,浸泡盐酸乙醇分化2-3 s后,用蒸馏水反蓝40-60 s。最后常规脱水,透明,自然晾干后封固。显微镜下观察并采图,使用ImageJ软件计算阳性区域面积进行统计分析。

1.6 qRT-PCR检测mRNA水平

用Trizole试剂提取肝内胆管癌患者癌组织和远端正常肝组织的总mRNA。按照反转录试剂盒说明书操作反转录为cDNA,反转录条件:25 ℃ 10 min,42 ℃ 50 min,85 ℃ 5 min。引物序列见表1。按照荧光定量PCR扩增试剂盒说明书操作,扩增条件设置:94 ℃预变性4 min,94 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,循环40次,72 ℃检测信号。使用2-ΔΔCt法来计算相对mRNA含量,ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH,ΔΔCt=ΔCt癌组织-ΔCt远端正常肝组织,2-ΔΔCt表示癌组织目的基因mRNA的相对含量较远端正常肝组织所改变的倍数。

表1 qRT-PCR引物序列

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 HE染色的基本病理变化

H&E染色结果显示,在癌组织中可见明显异形性的癌细胞,细胞核大而不规则,细胞排列紊乱,伴不同程度淋巴细胞浸润;而远端肝组织形态正常,可见正常肝小叶的结构(见图1)。其中高、中分化38例(76%),低分化12(24%)例,伴有淋巴结转移11例(22%)。

图1 HE染色观察基本病理变化(×200)

2.2 纤维化相关指标在肝内胆管癌组织中的表达

天狼猩红染色结果显示,在癌组织中,胶原主要沉积在间质细胞、血管或胆管周围,而在远端肝组织中仅少量沉积(见图2);定量结果显示,癌组织与远端肝组织中胶原沉积的差异具有统计学意义(P<0.01,见图2)。此外,α-SMA阳性细胞主要位于癌组织的胆管和血管周围,在细胞质或间质中高表达,呈淡黄色或棕黄色;定量结果显示,癌组织与远端肝组织中α-SMA阳性细胞比例的差异具有统计学意义(P<0.01,见图3)。qRT-PCR结果提示,癌组织中α-SMA mRNA表达量较远端正常肝组织明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01,见图3)。

图2 天狼星红染色检测胶原在肝内胆管癌组织中的表达

图3 α-SMA在肝内胆管癌组织中的表达

2.3 CK19标在肝内胆管癌组织中的表达

免疫组化结果显示,CK19阳性细胞主要定位于癌组织的胆管细胞质中,形成部分或完整的胆管结构,呈棕褐色(见图4);定量结果提示,在肝内胆管癌组织中CK19阳性细胞的表达量明显高于远端正常肝组织,差异有统计学意义(P<0.01,见图4)。qRT-PCR结果提示,癌组织中CK19 mRNA表达量较远端正常肝组织明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01,见图4)。

图4 CK19在肝内胆管癌组织中的表达

2.4 TGF-β1标在肝内胆管癌组织中的表达

免疫组化结果显示,TGF-β1阳性细胞主要定位于癌组织的细胞质或间质中,偶见于胞膜或胞核着色,在胆管和血管周围中高表达,呈淡黄色或棕黄色;定量结果提示,在肝内胆管癌组织中TGF-β1阳性细胞的表达量明显高于远端正常肝组织,差异有统计学意义(P<0.01,见图5)。qRT-PCR结果提示,癌组织中TGF-β1 mRNA表达量较远端正常肝组织明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01,见图5)。

图5 TGF-β1在肝内胆管癌组织中的表达

2.5 CD31标在肝内胆管癌组织中的表达

免疫组化结果显示,CD31阳性细胞主要定位于癌组织的细胞质中,在血管周围中高表达,呈淡黄色或棕黄色;定量结果提示,在肝内胆管癌组织中CD31阳性细胞的表达量明显高于远端正常肝组织,差异有统计学意义(P<0.01,见图6)。qRT-PCR结果提示,癌组织中CD31 mRNA表达量较远端正常肝组织明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01,见图6)。

图6 CD31在肝内胆管癌组织中的表达

2.6 在肝内胆管癌组织中所表达指标的相关性分析结果

Pearson相关性分析结果显示,α-SMA与CK19、TGF-β1、CD31,CK19与TGF-β1、CD31,TGF-β1与CD31在肝内胆管癌组织中的表达呈明显正相关(均P<0.01,见表2)。

表2 肝内胆管癌组织中所表达的各个指标之间的相关性分析

3 讨论

肝内胆管癌是一种原发于肝脏的常见恶性肿瘤,其发病率仅次于肝细胞性肝癌并逐年升高[8]。胆管癌的发生在胆管细胞增殖、分化和正常凋亡异常等遗传因素和表观遗传因素的共同作用下导致原癌基因和抑癌基因之间失衡[9]。大多数患者未及时发现,病情发展迅速,严重威胁患者生命。因此,研究肝内胆管癌发生、发展的生物学机制显得尤为重要。

研究表明,新生血管的形成不仅为肿瘤细胞的异常生长提供必要的氧气,而且促进癌细胞通过血液循环远处转移至其他组织器官[10]。癌组织微环境中的成纤维细胞等间质细胞、生长因子、细胞外基质在肿瘤细胞新生血管形成、增殖和转移过程中起了至关重要的作用[11]。TGF-β1作为在肿瘤信号转导通路中发挥多种关键作用的生物学效应分子,在多种恶性肿瘤组织均有高表达,其表达水平与恶性肿瘤的演进、血管的形成、转移密切相关[12,13]。成纤维细胞是肿瘤微环境中的关键细胞,在TGF-β1的作用下可激活。激活的成纤维细胞表达α-SMA并发生表型的改变,可以表达多种细胞因子,从而改善肿瘤细胞的微环境,促进肿瘤血管生成[14]。此外,胆管癌晚期高表达的TGF-β1能抑制免疫系统的正常功能,刺激新生血管的形成或通过旁分泌抑制癌细胞周围组织的过度增殖,减少癌细胞增殖、生长的空间限制,为癌细胞的快速生长创造良好的环境[15,16]。

本研究结果表明,在肝内胆管癌患者癌组织中可见明显异形性的癌细胞,细胞核大,细胞排列紊乱,伴有不同程度淋巴细胞浸润,提示淋巴细胞参与肝内胆管癌肿瘤微环境的构成[17]。天狼猩红染色观察组织中的胶原沉积情况,结果显示,胶原主要沉积在肝内胆管癌组织的血管、胆管周围,表明胶原沉积对肝内胆管癌血管的形成至关重要,这与近期研究结果一致[18]。本研究观察到50例肝内胆管癌患者癌组织中高表达α-SMA、CK19、TGF-β1、CD31,而远端正常肝组织中仅有少量表达。上述指标在肝内胆管癌组织中的表达呈正相关,提示α-SMA和TGF-β1在肝内胆管癌血管形成中发挥至关重要的作用。

总之,TGF-β1和α-SMA是肝内胆管癌发生发展的促进因素,直接或间接参与肝内胆管癌血管的形成。随着对TGF-β1、肿瘤微环境中间质细胞及所分泌细胞因子的深入研究,将对探讨肝内胆管癌血管形成、发病机制及诊治产生深远意义,靶向抑制肿瘤微环境中的血管形成有望成为肝内胆管癌诊治的新策略。