滇黄芩茎叶乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位的抗氧化和降脂活性研究

李欣坪 王蒙蒙 王子晨 方琼莲 林玉萍

摘 要 目的：研究滇黃芩茎叶乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位的抗氧化活性和降脂活性。方法：取滇黄芩茎叶用95%乙醇回流提取，得乙醇提取物;取上述提取物，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂得到不同溶剂萃取部位。以维生素C（Vc）为阳性对照，采用羟基自由基、超氧阴离子自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除法检测滇黄芩茎叶乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物的体外抗氧化活性并计算半数抑制浓度（IC50）。以脂肪乳建立脂肪变性L02肝细胞模型，以非诺贝特（20 μg/mL）为阳性对照，考察高、低质量浓度（100、50 μg/mL）滇黄芩茎叶乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物对细胞中TC、TG含量的影响。结果：对羟基自由基的清除能力强弱排序为滇黄芩茎叶正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>Vc>乙醇提取物>石油醚萃取物，IC50分别为0.15、0.17、0.35、0.75、1.17 mg/mL;对超氧阴离子自由基的清除能力强弱排序为Vc>正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>乙醇提取物>石油醚萃取物，IC50分别为0.034、0.55、0.75、3.32、3.73 mg/mL;对DPPH自由基的清除能力强弱排序为Vc>正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>乙醇提取物>石油醚萃取物，IC50分别为0.003 2、0.028、0.033、0.048、0.057 mg/mL。滇黄芩茎叶乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物对脂肪变性L02肝细胞中TC、TG含量均有显著的降低作用（P<0.01），其降脂能力强弱排序为正丁醇萃取物（低浓度）≈非诺贝特>乙酸乙酯萃取物（高浓度）>乙醇提取物（高浓度）>正丁醇萃取物（高浓度）>乙酸乙酯萃取物（低浓度）>乙醇提取物（低浓度）。结论：滇黄芩茎叶乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物均有一定的抗氧化活性和降脂活性（除石油醚萃取物外），其中正丁醇和乙酸乙酯萃取物的抗氧化活性和降脂活性较高。

关键词 滇黄芩茎叶;乙醇提取物;抗氧化活性;降脂活性

ABSTRACT   OBJECTIVE： To study the antioxidant activity and lipid-lowering effect of ethanol extract and its different solvent extracts from the stems and leaves of Scutellaria amoena. METHODS： The stem and leaves of S. amoena was extracted with 95% ethanol to obtain ethanol extract， and then extracted with petroleum，ethyl acetate and n-butanol to obtain corresponding different solvent extracts. Using vitamin C （Vc） as positive control， the antioxidant activities of ethanol extract， petroleum ether extract， ethyl acetate extract and n-butanol extract from the stems and leaves of S. amoena were determined by hydroxyl radical， superoxide anion radical and DPPH radical scavenging method， and the IC50 was calculated. Steatosis L02 hepatocyte model was established with fat emulsion. Using fenofibrate （20 μg/mL） as positive control， the effects of high and low concentration （100 and 50 μg/mL） ethanol extract， ethyl acetate extract and n-butanol extract from the stems and leaves of S. amoena on the contents of TC and TG in cells were investigated. RESULTS： The order of scavenging ability to hydroxyl radicals was n-butanol extract>ethyl acetate extract>Vc>ethanol extract>petroleum ether extract; IC50 of them were 0.15， 0.17， 0.35， 0.75， 1.17 mg/mL， respectively. The order of scavenging ability to superoxide anion radical was Vc>n-butanol extract>ethyl acetate extract>ethanol extract>petroleum ether extract; IC50 of them were 0.034， 0.55， 0.75， 3.32， 3.73 mg/mL， respectively. The order of DPPH scavenging ability to DPPH radical was Vc>n-butanol extract>ethyl acetate extract>ethanol extract>petroleum ether extract; IC50 of them were 0.003 2， 0.028， 0.033， 0.048， 0.057 mg/mL， respectively. The ethanol extract， ethyl acetate extract and n-butanol extract from the stems and leaves of S. amoena could significantly decrease the contents of TC and TG in steatosis L02 hepatocytes （P<0.01）. The order of lipid-lowering ability was n-butanol extract（low dose）≈fenofibrate>ethyl acetate extract（high dose）>ethanol extract（high dose）>n-butanol extract（high dose）>ethyl acetate extract（low dose）>ethanol extract（low dose）. CONCLUSIONS： The ethanol extract， petroleum ether extract， ethyl acetate extract and n-butanol extract from the stems and leaves of S. amoena show good antioxidant activity and lipid-lowering effect （except for petroleum ether extract）. Ethyl acetate extract and n-butanol extract possess the strongest antioxidant activity and lipid-lowering effect.

KEYWORDS   Stem and leaves of Scutellaria amoena; Ethanol extract; Antioxidant activity; Lipid-lowering activity

中图分类号 R285 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2021）02-0220-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.02.16

滇黄芩Scutellaria amoena C. H. Wright是云南地区多种民族药的药用资源，又名小黄芩、西南黄芩、土黄芩等，为唇形科黄芩属植物，主要分布在我国云南、四川、贵州等地[1-2]。《滇南本草》《中国彝药学》《云南民族药大辞典》等书记载，滇黄芩性寒、味苦，归肝、胆、胃、肺、大肠经，具有清肺胃热、燥湿气、消炎、解毒、安胎、止血等功效[3-4]。滇黄芩茎叶作为具有降脂作用的黄芩茶使用历史悠久，其主要含有黄酮类化合物[5]。近年来，随着对中药黄芩研究的不断深入，黄芩同属植物的药用价值日益受到国内外学者的关注，有关滇黄芩茎叶的药用价值已成为研究热点之一[6-7]。

现代药理研究报道显示，滇黄芩根部总黄酮具有较强的抗氧化活性，可抗心律失常并可阻滞心肌细胞钠通道[8-10];滇黄芩茎叶还具有降脂作用，可降低高脂血症模型大鼠的血脂水平[11]。但其醇提物及不同溶剂萃取部位抗氧化活性和降脂活性的比较研究尚未见报道。为此，本研究通过检测滇黄芩茎叶乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位对羟基自由基、超氧阴离子自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的清除能力来评价其体外抗氧化活性;采用脂肪变性人L02肝细胞模型，通过检测细胞內总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）含量的变化来评价其降脂活性，筛选其抗氧化和降脂活性的有效部位，为滇黄芩茎叶的进一步研究与开发奠定基础。

1 材料

1.1 仪器

本文所用实验仪器有：UV2450型紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司）、SHZ-D型循环水真空泵（巩义市予华仪器有限公司）、RE-2000A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅（上海医疗器械股份有限公司医疗器械五厂）、BT2202S型电子天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司]、Infinite M200 Pro型酶标仪（瑞士Tecan公司）、MCO-20AIC型CO2培养箱（日本Sanyo公司）、SK3300LH型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

滇黄芩全株采自云南省新平县，经云南中医药大学普春霞副教授鉴定为唇形科植物滇黄芩S. amoena C. H. Wright，取其茎叶进行研究。

20%脂肪乳注射液[批号201807，规格250 mL ∶ 50 g（大豆油） ∶ 3 g（卵磷脂）]购自四川科伦药业股份有限公司，青霉素-链霉素双抗溶液、0.25%胰蛋白酶、RPMI- 1640培养液、磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）、胎牛血清（批号0010419、0040819、0020319、2012004、1906287）均购自以色列BI公司，非诺贝特胶囊（批号28212，规格200 mg/粒）购自美国A bbott Laboratories Limited公司，TC、TG检测试剂盒（批号20200618、20200615）均购自南京建成生物工程研究所，DPPH购自美国Sigma公司，维生素C（Vc，批号20140102，纯度≥99.7%）和七水硫酸铁（FeSO4·7H2O）均购自广东光华科技股份有限公司，Trition X-100试剂（批号FZ6688A189）购自广州赛国生物科技有限公司，三羟甲基氨基甲烷（Tris）、磷酸二氢钠、30%H2O2溶液、邻苯三酚、邻二氮菲、磷酸氢二钠（均为分析纯）均购自天津市风船化学试剂科技有限公司，无水乙醇、盐酸、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇（均为分析纯）均购自云南杨林工业开发区汕滇药业有限公司;其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为超纯水。

1.3 细胞

正常人L02肝细胞株由中国科学院昆明动物研究所提供。

2 方法

2.1 滇黄芩茎叶乙醇提取物和不同溶剂萃取部位萃取物的制备

称取干燥的滇黄芩茎叶400 g，加入95%乙醇3 200 mL，加热回流提取3次，提取时间分别为2、1、1 h，减压过滤，合并提取液，减压蒸馏回收乙醇，干燥，得到滇黄芩茎叶乙醇提取物30.72 g（得率7.68%）。取上述乙醇提取物25 g，用水重悬，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，分别得到石油醚萃取物4.03 g（得率16.12%）、乙酸乙酯萃取物9.16 g（得率36.64%）、正丁醇萃取物3.42 g（得率13.68%）。

2.2 抗氧化试验

2.2.1 样品溶液的配制 分别称取滇黄芩茎叶乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和Vc各0.05 g，加水20 mL，超声（功率200 W，频率53 kHz）处理5 min，滤过，滤液用水定容于50 mL量瓶中，配制成质量浓度均为1.0 g/mL（以提取物或Vc质量计，下同）的母液，备用。临用时用水稀释至所需浓度，浓度按预试验结果设置。

2.2.2 对羟基自由基的清除能力的检测 参考文献[12]方法，在10 mL具塞试管中，分别加入质量浓度分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL（乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和Vc）或0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL（乙醇提取物、石油醚萃取物）的样品溶液和0.75 mmol/L FeSO4·7H2O溶液各1 mL，再加入0.75 mmol/L邻二氮菲溶液和0.01%H2O2溶液各1 mL，于37 ℃保温1 h，取出，使用紫外-可见分光光度计在536 nm波长处检测吸光度（An′）;另以水替代H2O2溶液同法检测吸光度（An），以水替代样品溶液同法检测吸光度（A0′），以水替代样品溶液和H2O2溶液同法检测吸光度（A0）。以Vc作为阳性对照，每个样品重复检测3次，取平均值，计算羟基自由基清除率：羟基自由基清除率（%）=[1-（An-An′）/（A0-A0′）]×100%。以清除率（y，%）为纵坐标、质量浓度（x，mg/mL）为横坐标进行回归分析，计算半数抑制浓度（IC50）。

2.2.3 对超氧阴离子自由基的清除能力的检测 参考文献[13]方法，在10 mL具塞试管中，分别加入质量浓度分别为0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 mg/mL（Vc）或0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL（乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物）或1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL（乙醇提取物、石油醚萃取物）的样品溶液1 mL、0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.2）4.5 mL，在25 ℃下恒温水浴20 min，再加入3 mol/L的邻苯三酚溶液0.5 mL，迅速混匀后于37 ℃下保温5 min，立即加入浓盐酸（8 mol/L）2滴终止反应，使用紫外-可见光光度计在425 nm波长处检测吸光度（A1）;另以水替代邻苯三酚溶液同法检测吸光度（A2），以水替代样品溶液同法检测吸光度（A0）。以Vc作为对照，每个样品重复检测3次，取平均值，计算超氧阴离子自由基清除率：超氧阴离子自由基清除率（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100%。按“2.2.2”项下方法计算IC50。

2.2.4 对DPPH自由基的清除能力的检测 参考文献[14]方法，在10 mL具塞试管中，分别加入质量浓度分别为0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006 mg/mL（Vc）或0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 mg/mL（乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物）的样品溶液和0.125 mmol/L DPPH溶液各2 mL，混匀，于37 ℃水浴中反應30 min，使用紫外-可见光光度计在517 nm波长处检测吸光度（A1）;以无水乙醇替代DPPH溶液同法检测吸光度（A2），以无水乙醇替代样品溶液同法检测吸光度（A0）。以Vc作为对照，每个样品重复检测3次，取平均值，计算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100%。按“2.2.2”项下方法计算IC50。

2.3 降脂试验

2.3.1 供试品药液的配制 分别精密称滇黄芩茎叶乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物（根据抗氧化活性结果选择样品，其中石油醚萃取物抗氧化活性欠佳，故不进行降脂试验）各2.0 g，用二甲基亚砜（DMSO）溶解配制成质量浓度均为1 mg/mL的母液，再用RPMI- 1640培养液将其稀释成100、50 μg/mL的供试品药液。同法将非诺贝特（阳性对照）配制成质量浓度为20 μg/mL的供试品药液。浓度按预试验结果设置。

2.3.2 培养液和造模液的配制 （1）含0.2%胎牛血清的RPMI-1640培养液：将胎牛血清1 mL和青霉素-链霉素双抗溶液5.6 mL加入至RPMI-1640培养液500 mL中，即得含0.2%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640培养液。（2）含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液：将胎牛血清55 mL和青霉素-链霉素双抗溶液5.6 mL加入至RPMI-1640培养液500 mL中，即得含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640培养液。（3）10%医用脂肪乳造模液：将医用脂肪乳10 mL加入至含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液90 mL中，即得。

2.3.3 脂肪变性L02肝细胞模型的建立 参考文献方法[15]，取对数生长期的L02肝细胞用0.25%胰蛋白酶消化，按5×105个/孔接种于6孔板中，于37 ℃、5%CO2培养箱及饱和湿度条件（培养条件下同）下培养，当细胞长至80%融合时，用含0.2%胎牛血清的RPMI-1640培养液进行饥饿处理24 h，使细胞周期同步化，随后每孔加入10%医用脂肪乳造模液2 mL，继续培养24 h，以建立脂肪变性L02肝细胞模型。

2.3.4 分组、给药与处理 将细胞周期同步化后的细胞分为正常对照组、模型组、非诺贝特组和提取物/萃取物高、低浓度组，每组设3个复孔。除正常对照组细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中培养24 h外，其余各组细胞均按“2.3.3”项下方法建模。建模后，正常对照组和模型组细胞分别加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液2 mL，非诺贝特组和提取物/萃取物高、低浓度组细胞分别加入“2.3.1”项下供试品药液2 mL。培养24 h后，用PBS清洗细胞2～3次，收集细胞并置于1.5 mL离心管中，以2 000 r/min离心3 min，弃上清液，沉淀加入2%Triton X-100试剂30 μL，反复冻融3次，待细胞充分裂解后，于4 ℃下以5 000 r/min离心10 min，取上清液，按生化法以酶标仪测定TC和TG的含量，具体操作按试剂盒说明书操作。

2.4 数据处理

统计图和回归分析采用GraphPad Prism 5.0软件处理，统计学分析使用SPSS 18.0软件完成。结果均以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 滇黄芩茎叶乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位对羟基自由基清除能力的影响

滇黄芩茎叶乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位对羟基自由基均有不同程度的清除能力，其清除率有随质量浓度增加而升高的趋势。其中，滇黄芩茎叶乙醇提取物和石油醚萃取物对羟基自由基的清除能力均弱于Vc，而其乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物对羟基自由基的清除能力均强于Vc。各提取物/萃取物清除能力强弱（即IC50由小到大）排序为：正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>Vc>乙醇提取物>石油醚萃取物。回归分析结果显示，滇黄芩茎叶乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的质量浓度与清除率的相关系数（R 2）均大于0.9，表明其对羟基自由基的清除能力与质量浓度之间具有良好的线性关系。滇黄芩茎叶乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位对羟基自由基清除能力的影响见图1，回归分析结果见表1。

3.2 滇黄芩茎叶乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位对超氧阴离子自由基清除能力的影响

滇黄芩茎叶乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位对超氧阴离子自由基均有不同程度的清除能力，其清除率有随质量浓度增加而升高的趋势，但当乙醇提取物和石油醚萃取物的质量浓度≥4 mg/mL时，其清除率上升减慢。滇黄芩茎叶乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位对超氧阴离子自由基的清除能力强弱（即IC50由小到大）排序为：Vc>正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>乙醇提取物>石油醚萃取物。回归分析结果显示，滇黄芩茎叶乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的质量浓度与清除率的R 2均大于0.9，表明其对超氧阴离子自由基的清除能力与质量浓度之间具有良好的线性关系。滇黄芩茎叶乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位对超氧阴离子自由基清除能力的影响见图2，回归分析结果见表2。

3.3 滇黄芩茎叶乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位对DPPH自由基清除能力的影响

滇黄芩茎叶乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位对DPPH自由基均有不同程度的清除能力，其清除率有随质量浓度增加而升高的趋势。滇黄芩茎叶乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位对DPPH自由基的清除能力强弱（即IC50由小到大）排序为：Vc>正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>乙醇提取物>石油醚萃取物。回归分析结果显示，滇黄芩茎叶乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位的质量浓度与清除率的R 2均大于0.9，表明其对DPPH自由基的清除能力与质量浓度之间具有良好的线性关系。滇黄芩茎叶乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位对DPPH自由基清除能力的影响见图3，回归分析结果见表3。

3.4 滇黄芩茎叶乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位对脂肪变性L02肝细胞中TC、TG水平的影响

与正常对照组比较，模型组细胞中TC、TG含量均显著升高（P<0.01）。与模型组比较，各给药组细胞中TC、TG含量均显著降低（P<0.01），说明滇黄芩茎叶乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位均能显著降低脂肪变性L02细胞中的TC、TG水平，降脂活性强弱（即TC、TG变化程度）排序为：正丁醇萃取物（低浓度）≈非诺贝特>乙酸乙酯萃取物（高浓度）>乙醇提取物（高浓度）>正丁醇萃取物（高浓度）>乙酸乙酯萃取物（低浓度）>乙醇提取物（低浓度）。滇黄芩茎叶乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位对脂肪变性L02肝细胞中TG、TC含量的影响见表4。

4 讨论

自由基是机体正常代谢的产物，其含量轻微增加可提升机体抗氧化的能力;但当自由基含量过高时，其会攻击细胞膜造成机体的损伤[16]。近年来医学研究证实，诸多疾病，例如恶性肿瘤、动脉粥样硬化、糖尿病、脂代谢异常等都与人体内异常积聚的自由基有关[17-18]。中药含有的黄酮类、酚类、皂苷、多糖等化学成分具有良好的抗氧化活性，寻找天然抗氧化剂来清除人体内的自由基从而预防相关疾病的发生已成为研究热点之一[19-21]。

本研究采用羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基清除法对滇黄芩茎叶乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位的抗氧化能力进行了评价。结果表明，滇黄芩茎叶乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位对羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基均表现出不同程度的清除作用，并呈一定的量效关系趋势。其中，正丁醇和乙酸乙酯萃取物的抗氧化作用较强（IC50均相对较小），提示滇黄芩茎叶抗氧化活性成分可能主要集中在正丁醇和乙酸乙酯部位。本文同时以脂肪变性L02细胞中TC、TG含量的变化来评价具有显著抗氧化活性的乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物的降脂活性，并选择了常用于治疗高TG血症、血脂异常、糖尿病等代谢性疾病的非诺贝特为阳性药物[22]。研究表明，滇黄芩茎叶乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物均能显著降低脂肪变性L02细胞中TC、TG含量，具有明显的降脂活性。

综上所述，滇黄芩茎叶乙酸乙酯和正丁醇部位的抗氧化和降脂活性较强，可作为探究滇黄芩茎叶抗氧化和降脂活性部位继续研究。

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（收稿日期：2020-09-13 修回日期：2020-12-13）

（编辑：邹丽娟）