黄芪多糖的提取与抗氧化活性检测

吴铭++韩丹++郭立泉

摘要：利用超声波提取法从黄芪（Radix astragali）中提取多糖，应用正交试验法优化提取条件，并采用超氧阴离子和DPPH自由基体系对黄芪多糖的抗氧化活性进行研究。结果表明，黄芪多糖提取的最佳条件为固液比1∶20、超声提取时间12 min、超声功率65 W、超声提取温度60 ℃，在此条件下，黄芪多糖提取率为8.75%。抗氧化活性试验结果表明，黄芪多糖具有较高的清除DPPH自由基和超氧阴离子自由基的活性。

关键词：黄芪（Radix astragali）多糖；超声波提取； 正交试验；抗氧化活性

中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）17-4263-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.17.040

黄芪（Radix astragali）是一种常见的中药，属于豆科黄芪属，以根入药，具有补气升阳、脱毒、利水消肿、益胃固表等功效，是中国传统的补益药[1]。现代医药研究发现，它能有效治疗各种疾病，已被广泛应用于增强人体的免疫系统[1，2]。黄芪含有大量的生物活性成分，包括皂苷、黄酮和多糖[3]。多糖是黄芪已确定的主要生物活性成分之一。有研究表明，黄芪多糖有抗肿瘤、抗氧化、抗高血压和免疫调节活性[4]。

黄芪多糖的提取方法是研究黄芪多糖活性的第一步，最常见的提取方法是利用传统的溶剂萃取法从植物中提取多糖，但这些方法通常存在提取时间较长、提取温度较高，且提取效率较低等缺点[5，6]。近年又发展了几种从植物中提取多糖的新技术，包括超临界流体萃取法，超声波提取法和微波提取法。其中，超声波提取法相比其他方法对植物材料的结构和分子性质损害更低[7]。利用超声波的空化作用、机械效应和热效应可以加强胞内物质的释放、扩散和溶解，从而显著提高提取效率[8，9]。由于这些原因，超声波提取法被广泛应用于植物多糖的提取。本研究利用超声波提取法从黄芪中提取黄芪多糖（RAP），应用正交试验优化提取条件，然后采用超氧阴离子自由基体系和DPPH自由基体系对黄芪多糖的抗氧化活性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

干黄芪购买于长春市草药药店。DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）、BHT（Butylated hydroxy toluene）、NADH（Nicotinamide adenine dinucleotide）和NBT（Nitroblue tetrazolium）为Sigma公司产品；其他的化学试剂均为分析纯。

1.2 黄芪多糖的提取及单因素试验

将干黄芪磨成细粉，过40目筛。然后将干粉沉浸在去离子水中，调整固液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，m/V，g∶mL）、超声提取时间（5、10、15、20、25 min）、超声功率（40、50、60、70、80 W）和超声提取温度（30、40、50、60、70 ℃），收集提取液，于3 000 r/min离心10 min，取上清，按sevag法（氯仿/正丁醇=5∶1）脱蛋白质，用真空旋转蒸发仪将滤液浓缩，取滤液加4倍体积的95%乙醇进行沉淀，放置过夜，次日以3 000 r/min离心10 min，取沉淀用丙酮和乙醇清洗，得到粗多糖。多糖提取率的计算公式为：Y=m2/m1×100%，其中，Y表示多糖提取率（%），m1表示多糖的质量（g），m2表示干黄芪样品质量（g）。

1.3 黄芪多糖提取正交优化试验

在单因素试验的基础上，对固液比、超声提取时间、超声功率和超声提取温度进行4因素3水平的L9（34）正交试验，试验因素与水平见表1。

1.4 黄芪多糖的抗氧化活性测定

1.4.1 DPPH自由基体系[10] 将黄芪多糖配成不同浓度（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL）的待测液，另外用50%乙醇配置6 mg/100 mL的DPPH溶液。在试管中依次加入1 mL黄芪多糖不同浓度待测液和2 mL DPPH溶液，室温放置（避光）反应30 min，然后在517 nm处测定吸光度，以1 mL 50%乙醇加入到2 mL DPPH溶液中作为空白对照，以二叔丁基对甲酚（BHT）作为参照。每个样品做3个平行样，取其平均值。DPPH清除率计算公式如下：

SCDPPH=（1-■）×100%

式中，SCDPPH为DPPH的清除率；AS517 nm为样品的吸光度；Ac517 nm为对照的吸光度。

1.4.2 超氧阴离子自由基体系 将黄芪多糖配成不同浓度（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL）的待测液，取1 mL NTB溶液（156 μmol/L NBT溶于100 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.4）、1 mL NADH溶液（468 μmol/L NADH溶于100 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.4）和1 mL不同浓度黄芪多糖待测液，混匀后，加入100 μL的PMS溶液（60 μmol/L PMS溶于100 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.4），混匀后置于25 ℃水浴中反应5 min，然后在560 nm处测定吸光度，以空白样品作为对照，以BHT作为参照。每个样品做3个平行样，取其平均值。超氧阴离子清除率计算公式如下：

SC■=（1-■）×100%

式中，SC■为超氧阴离子的清除率；AS517 nm为样品的吸光度；AC517 nm为对照的吸光度。

2 结果与分析

2.1 黄芪多糖提取的单因素试验结果

在超声提取时间为10 min、超声功率为60 W、超声提取温度为50 ℃时，考察固液比对黄芪多糖提取的影响，结果（图1A）表明，黄芪多糖提取的最佳固液比例为1∶20。在此基础上，对超声提取时间进行单因素试验，结果（图1B）表明，最适超声提取时间为10 min。进一步对超声功率进行单因素试验，结果（图1C）表明，最适超声功率为70 W。最后，在上述各最适条件的基础上，考察超声提取温度对黄芪多糖的影响，结果（图1D）表明，最适超声提取温度为60 ℃。

2.2 黄芪多糖提取的正交试验优化结果

黄芪多糖提取条件的正交试验优化结果见表2。由表2可知，4个因素对黄芪多糖提取率影响的主次因素为A、B、D、C，最佳提取条件组合是A2B2C1D2，实际试验组合中以A2B3C1D2提取率最高，方差分析可知B因素2水平与3水平差异不显著，因此选取A2B3C1D2为最佳组合，即固液比为1∶20，超声提取时间为12 min，超声功率为65 W，超声提取温度为60 ℃，在此条件下，黄芪多糖的提取率为8.75%。

2.3 黄芪多糖的抗氧化活性检测结果

由图2A可知，在浓度为0～0.20 mg/mL时，黄芪多糖对DPPH自由基的清除率比参照BHT弱，当浓度为0.25～0.30 mg/mL时，黄芪多糖对DPPH自由基的清除率超过了BHT。由图2B可知， 随着浓度的增加，黄芪多糖和BHT对超氧阴离子自由基的清除率也随之增强，且BHT对超氧阴离子的清除率一直高于黄芪多糖。总的来说，黄芪多糖具有较高的清除DPPH自由基和超氧阴离子自由基的活性，且对DPPH自由基的清除能力更强。

3 小结

超声波提取法已经被广泛应用于黄芪多糖的快速提取，由正交试验结果可知，黄芪多糖最佳提取条件为固液比1∶20、超声提取时间12 min、超声功率65 W、超声提取温度60 ℃，在此条件下，黄芪多糖的提取率为8.75%。此外， 通过对黄芪多糖清除超氧阴离子自由基和DPPH自由基的研究表明，黄芪多糖具有清除DPPH自由基和超氧阴离子自由基的活性，黄芪多糖的抗氧化活性和抗氧化机制有待进一步研究。

参考文献：

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