甘草饮片中抗氧化活性成分的快速筛选及鉴定

2021-02-21化敏周倩蒋海强戴衍朋石典花王平张乐林周建永

中国药房 2021年2期

化敏周倩蒋海强戴衍朋石典花王平张乐林周建永

摘要目的：建立在线检测甘草饮片中抗氧化活性成分的方法，并对其进行鉴定。方法：通过检测1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）清除率来评价甘草饮片的抗氧化活性;采用在线高效液相色谱-紫外-1，1-二苯基-2-三硝基苯肼法（HPLC-UV-DPPH）筛选甘草饮片中的抗氧化活性成分;采用高效液相色谱-飞行时间高分辨质谱法（HPLC-TOF/MS）获取质谱数据并采用Qualitive Analyst B 06.00 Build 6.0.633.0软件进行分析，通过对比分析甘草的紫外吸收光谱、在线图谱、质谱信息及各化合物的保留时间、精确分子量，结合参考相关文献初步鉴定抗氧化活性成分，并进行验证。结果：8批甘草饮片的DPPH清除率为55.71%～60.17%，均可筛选出7种抗氧化活性成分，经鉴定分别为阿佛洛莫生、8-异戊烯基柚皮素、黄羽扇豆魏特酮、半甘草异黄酮B、3′，4′-二甲氧基-3-羟基-6-甲基黄酮、甘草宁E和甘草宁H。经验证，在线反应产生的倒峰峰面积与饮片的DPPH清除率呈正相关。结论：所建方法简单、准确，可用于快速筛选并鉴定甘草饮片的抗氧化活性成分，倒峰峰面积可用于评价甘草饮片的抗氧化活性成分大小。

关键词甘草;抗氧化活性成分;在线高效液相色谱-紫外-1，1-二苯基-2-三硝基苯肼法;高效液相色谱-飞行时间高分辨质谱法;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼;结构鉴定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for online detection of antioxidant active components in Glycyrrhiza uroalensis decoction pieces， and to identify it. METHODS： The free radical scavenging rate of 1，1-diphenyl-2-trinitrobenzene hydrazine （DPPH） was determined to evaluate the antioxidant activity of G. uralensis decoction pieces. HPLC-UV-DPPH method was used to screen the antioxidant active components of G. uralensis decoction pieces. HPLC-TOF/MS was used to obtain mass spectrum data and Qualitive Analyst B 06.00 Build 6.0.633.0 software was used to analyze data. Through contrast analysis of UV absorption spectrum， online chromatogram， mass spectrum information of G. uralensis and the retention time of each compound， accurate molecular weight， antioxidant active components were identified by referring to relevant literature. Validation test was also conducted. RESULTS： DPPH free radical scavenging rate in 8 batches of G. uralensis decoction pieces ranged 55.71%-60.17%. Seven antioxidative active compounds， including avolomotor， 8-isopentenyl naringin， yellow lupulin weitone， isoflavone B， 3′，4′-dimethoxy3-hydroxy-6-methyl flavone， glycyrrhizin E and glycyrrhizin H， could be screened from G. uralensis decoction pieces. After validation， the peak area of inverted peak generated by online reaction was positively correlated with DPPH free radical scavenging rate. CONCLUSIONS： Established method is simple and accurate， and can be used to quickly screen and identify the main antioxidant components of G. uralensis decoction pieces; the peak area of inverted peak can be used to evaluate the antioxidant active components of G. uralensis decoction pieces.

KEYWORDS Glycyrrhiza uralensis; Antioxidant active component; Online HPLC-UV-DPPH;HPLC-TOF/MS;1，1-diphenyl-2-trinitrobenzene hydrazine; Structural identification

中圖分类号 R932 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2021）02-0176-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.02.09

甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎，主要分布于我国东北、华北、甘肃、新疆等地[1]。甘草具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效，除可用于治疗脾胃虚弱、倦怠乏力、心悸气短、咳嗽痰多、脘腹、四肢挛急疼痛等症外，还可用于缓解药物毒性和烈性[2]。现代药理研究表明，甘草具有较强的抗氧化活性，其作为一种天然的抗氧化剂，已在食品、化妆品等多个领域中得到了广泛应用[3-4];同时，甘草的抗炎、杀菌、抗衰老等药理活性均与其抗氧化性活性密切相关[5-7]，因此筛选甘草的抗氧化活性成分可为该药药效作用物质基础研究提供数据支持。

有研究发现，甘草中的抗氧化活性成分主要包括黄酮[8]、多糖[9]和三萜[10]等多种化合物，但具体的抗氧化成分组成尚不明确。目前，甘草化学成分的研究方法主要有气质联用技术（GC-MS）、高效液相色谱法（HPLC）、HPLC指纹图谱和液质联用技术（LC-MS）等[11-13]，这些方法虽然可以得到丰富的化学成分信息，但均未明确成分与药效的关系，因此无法对甘草饮片的质量和药效进行评价。

随着科学技术的进步，中药活性成分辨识技术得到了一定的发展，形成了以药物基本特性为基础的色谱分离和在线监测技术[14-15]。自由基是指物质分子在光或热等外界条件影响下因共价键均裂所形成的含有不成对电子的原子、分子或基团。生物体内自由基的产生和清除及氧化损伤与心血管疾病的发生发展密切相关[16]。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）是一种常见的自由基，常用来监测物质的抗氧化活性[17-18]。鉴于此，本研究采用高效液相色谱-紫外-1，1-二苯基-2-三硝基苯肼法（HPLC-UV-DPPH）对甘草提取物清除DPPH的活性进行在线检测和评价，以快速筛选甘草饮片中的抗氧化活性成分;同时，结合高效液相色谱-飞行时间高分辨质谱法（HPLC-TOF/MS）对筛选出的抗氧化活性成分进行初步鉴定，旨在为甘草抗氧化物质基础的研究提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260型HPLC仪（含在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱）和Agilent 6230 TOF LC/MS型四级杆飞行时间质谱仪（含电喷雾离子源、Mass Hunter Data Acquisition B.06.01在线工作站、Qualiative Analysis B 06.00 Build 6.0.633.0离线分析软件）均购自美国Agilent公司;ACQUITY H-Class型HPLC仪（包括四元溶剂管理器、样品管理器、二极管阵列检测器、Empower 7.20.00.00色谱工作站）购自美国Waters公司;xMark型酶标仪购自南京德铁实验设备有限公司;XS205DU型万分之一电子天平购自瑞士Mettler Toledo公司;KQ- 300VED型三频数控超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司;DHG-9146型电热恒温鼓风干燥箱购自上海精宏实验设备有限公司。

1.2 药品与试剂

实验用药品和试剂有：DPPH标准品（合肥博美生物科技有限责任公司，批号464RB，纯度≥97%）等;乙腈为色谱纯，甲醇、甲酸、无水乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等為分析纯，水为超纯水。

8批甘草饮片（编号S1～S8）经山东省中医药研究院孙立立研究员鉴定为豆科植物甘草G. uralensis Fisch.的干燥根和根茎，样本保存于本实验室，其来源信息见表1。

2 方法与结果

2.1 甘草饮片DPPH清除率的检测

2.1.1 供试品溶液的制备取甘草饮片（编号S6），粉碎，过60目筛，取约0.25 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声（功率250 W，频率40 kHz，下同）处理30 min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.2 DPPH甲醇溶液的制备取DPPH标准品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为0.266 3 μmol/mL的DPPH甲醇溶液，置于4 ℃冰箱中保存，备用。

2.1.3 半数抑制浓度（IC50）的测定取“2.1.1”项下供试品溶液适量，加甲醇稀释，制成质量浓度分别为10.00、2.00、1.00、0.80、0.40、0.20、0.10、0.04 mg/mL（以生药量计）的样品溶液。分别取上述不同质量浓度的样品溶液2 mL，置于EP管中，加入“2.1.2”项下DPPH甲醇溶液2 mL，摇匀，置于暗处反应30 min，使用酶标仪于517 nm波长处测定样品溶液与DPPH甲醇溶液混合液的吸光度（Ai）;同时，测定空白对照溶液（甲醇）的吸光度（A0）、样品溶液与甲醇混合液（等体积混合，于暗处反应30 min）的吸光度（Aj），每样品重复测定3次，求平均值，计算DPPH清除率和IC50。DPPH清除率（%）=（1-[Ai-Aj

A0] ）×100%[19]。结果，上述各质量浓度供试品溶液的DPPH清除率分别为98.38%、74.36%、62.55%、51.71%、50.95%、45.07%、44.88%、44.74%，IC50为0.24 mg/mL。

2.1.4 甘草饮片DPPH清除率的检测按“2.1.3”项下IC50结果，分别称取8批甘草饮片粉末，约0.25 g，精密称定，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，精密量取0.6 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容，按“2.1.3”项下方法测定吸光度并计算DPPH清除率，结果见表2。由表2可知，8批甘草饮片的DPPH清除率为55.71%～60.17%，其中S8样品的DPPH清除率最高，S7样品最低。

2.2 甘草抗氧化活性成分的筛选与鉴定

2.2.1 供试品溶液的制备取甘草饮片粉碎，过60目筛，取约0.75 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加甲醇15 mL，密塞，超声处理30 min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，置于4 ℃冰箱中保存，备用。

2.2.2 DPPH甲醇溶液的制备按“2.1.2”项下方法制备浓度为80 μmol/L的DPPH甲醇溶液，置于4 ℃冰箱中保存，备用。

2.2.3 HPLC-UV-DPPH的色谱条件以Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱;以乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～10 min，15%A→25%A;10～20.3 min，25%A→30%A;20.3～70 min，30%A→70%A;70～75 min，70%A→15%A）;检测波长为254 nm;柱温为30 ℃;流速为0.8 mL/min;进样量为10 μL。柱后自由基分析系统的流动相为80 μmol/L DPPH甲醇溶液;流速为0.8 mL/min;检测波长为517 nm;柱后温度为30 ℃。

2.2.4 HPLC-TOF/MS的色谱与质谱条件以Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱;以乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～10 min，15%A→25%A;10～20.3 min，25%A→30%A;20.3～70 min，30%A→70%A;70～75 min，70%A→15%A）;检测波长为254 nm;柱温为30 ℃;流速为0.8 mL/min;进样量为2 μL。质谱条件为三通分流至0.27 mL/min;离子源为电喷雾离子源;离子模式为正离子模式;全扫描范围为m/z 100～1 000;毛细管电压为4 000 V;干燥气体积流量为8 L/min;温度为350 ℃;裂解电压为300 V;锥孔电压为65 V;雾化气压力为30 psi。

2.2.5 数据分析采用Qualitive Analyst B 06.00 Build 6.0.633.0软件对HPLC-TOF/MS所得数据进行分析。通过对比分析甘草的紫外吸收光谱、在线图谱、质谱信息及各化合物的保留时间、精确分子量，同时参考相关文献[20-25]，对可能存在抗氧化活性的成分进行鉴定。

2.2.6 抗氧化活性成分的检测与鉴定结果取“2.2.1”项下供试品溶液适量，按“2.2.3”“2.2.4”项下条件进样分析，记录色谱图。结果，甘草饮片在线鉴别出7种抗氧化活性成分，经鉴定分别为阿佛洛莫生、8-异戊烯基柚皮素、黄羽扇豆魏特酮、半甘草异黄酮B、3′，4′-二甲氧基-3-羟基-6-甲基黄酮、甘草宁E、甘草宁H。甘草饮片的高效液相色谱图见图1（图中，峰1～7分别对应上述化合物，后图同），DPPH自由基在线图谱见图2，甘草饮片的总离子流图见图3，甘草饮片质谱图所对应的色谱图见图4，其抗氧化活性成分的结构式见图5，其质谱鉴定结果见表3。

2.3 裂解规律及特征分析

化合物1：保留时间为49.542 min（以图4为例，下同），在正离子模式下出现准分子离子峰m/z 299.092 6[M+H]+，推断可能的分子式为C17H14O5。进一步进行碎片扫描，发现主要碎片m/z 284.332 2，推测可能为准分子离子脱掉1分子CH3所得;同时，还存在m/z 132.101 5[C9H8O]的中性分子以及m/z 136.112 2的[M+H-OCH3-C9H8O]+的碎片离子。根据以上信息并参考相关文献[20-21]，推测该化合物为阿佛洛莫生。

化合物2：保留时间为50.450 min，在正离子模式下出现准分子离子峰m/z 341.139 5[M+H]+，推断可能的分子式为C20H20O5。进一步进行碎片扫描，发现主要碎片m/z 285.076 1，推测可能为准分子离子通过质谱裂解丢失m/z 56.013 1的碎片峰，提示有异戊烯基结构存在。根据以上信息并参考相关文献[21-22]，推测该化合物为8-异戊烯基柚皮素。

化合物3：保留时间为53.173 min，在正离子模式下出现准分子离子峰m/z 339.124 5[M+H]+，推测可能的分子式为C20H18O5。进一步进行碎片扫描，发现主要碎片离子m/z 147.090 0[M+H-C11H12O3]+及m/z 119.082 7[M+H-C12H12O4]+。根據以上信息并参考相关文献[23]，同时结合化合物极性，推测该化合物为黄羽扇豆魏特酮。

化合物4：保留时间为59.224 min，在正离子模式下出现准分子离子峰m/z 353.104 8[M+H]+、m/z 375.082 7 [M+Na]+，推测可能的分子式为C20H16O6。进一步进行碎片扫描，发现主要碎片m/z 257.570 8[M+H-C3O2-CO]+。根据以上信息并参考相关文献[24]，同时结合裂解规律，推测该化合物为半甘草异黄酮B。

化合物5：保留时间为64.620 min，在正离子模式下出现准分子离子峰m/z 313.105 8[M+H]+，推测可能的分子式为C18H16O5。进一步进行碎片扫描，发现主要碎片离子m/z 270.315 0为准分子离子失去甲基后又失去CO中性分子所得。根据以上信息并参考相关文献[25]，同时结合化合物极性，推测该化合物可能为3′，4′-二甲氧基-3-羟基-6-甲基黄酮。

化合物6：保留时间为67.494 min，在正离子模式下出现准分子离子峰m/z 425.196 8[M+H]+，推测可能的分子式为C25H28O6。进一步进行碎片扫描，发现准分子离子失去1分子H2O产生碎片离子m/z 407.184 4，同时存在碎片离子m/z 369.167 6和m/z 313.106 5，判断可能有两个异戊烯基。根据以上信息并参考相关文献[23]，推测该化合物为甘草宁E。

化合物7：保留时间为68.755 min，在正离子模式下出现准分子离子峰m/z 421.163 9[M+H]+，推测可能的分子式为C25H24O6。进一步进行碎片扫描，发现在m/z 365.101 0处出现碎片离子，提示可能含有异戊烯基或准分子离子失去两分子CO所致，结合文献[22]可知[M+H-2CO]-为异黄酮的特征离子峰。根据以上信息并参考相关文献[21-22]，推测该化合物为甘草宁H。

2.4 抗氧化活性成分检测方法的验证

取8批甘草饮片，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.3”项下条件进样分析，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》生成8批甘草饮片的HPLC叠加特征图谱。结果，8批甘草饮片均可检测出7种抗氧化活性成分。同时，结合表2中不同产地甘草饮片的DPPH清除率结果，发现在线反应产生的倒峰峰面积与饮片的DPPH清除率呈正相关，提示可用倒峰峰面积初步评价抗氧化活性成分的大小，详见图6、图7、表4。

3 讨论

在中药现代化研究领域中，抗氧化中药的研究占重要地位，已有针对清热类、补益类中药等抗氧化活性的系列研究报道[26-28]，以及对中药中所含抗氧化活性成分的研究[29]。甘草作为临床应用较广泛的中药之一，具有抗氧化活性，且多种药理活性与抗氧化活性密切相关[16，30]。目前，关于甘草抗氧化活性的研究较少，也尚无甘草抗氧化活性成分的相关研究。中药的质量控制需以药效成分的辨识和确认为基础，只有科学合理的药效成分研究才是保证中药安全有效的前提[31]。因此，本研究以提升饮片质量标准为目标，借助“中药活性成分色谱辨识”技术，建立了甘草饮片的HPLC-UV-DPPH在线检测方法，以用于甘草抗氧化活性成分的快速筛选。结果，甘草饮片中共筛选出7种抗氧化活性成分，经HPLC-TOF/MS法鉴定分别为阿佛洛莫生、8-异戊烯基柚皮素、黄羽扇豆魏特酮、半甘草异黄酮B、3′，4′-二甲氧基-3-羟基-6-甲基黄酮、甘草宁E和甘草宁H。其中，阿佛洛莫生、8-异戊烯基柚皮素和半甘草异黄酮B已有抗氧化活性的相关报道[32-34]，而黄羽扇豆魏特酮、3′，4′-二甲氧基-3-羟基-6-甲基黄酮、甘草宁E和甘草宁H未见报道。DPPH是一种稳定的以氮为中心的自由基，在517 nm波长处具有特征吸收，以DPPH甲醇溶液为流动相，在517 nm波长下可得到平整的基线;当样品中存在可与自由基反应的成分时，其可与DPPH反应，通过DPPH中的单电子配对而使其吸收逐渐消失，在色谱图上表现为负峰，利用该原理可进行抗氧化活性成分的在线筛选。本研究中的8批甘草饮片的7种抗氧化活性成分在其出现的对应时间处均表现为倒峰，且倒峰的峰面积与甘草饮片的DPPH清除率呈正相关，提示可通过比较倒峰峰面积来评价甘草饮片的抗氧化活性。

综上所述，所建方法简单、准确，可用于快速筛选并鉴定甘草饮片的抗氧化活性成分，倒峰峰面积可用于评价甘草饮片的抗氧化活性成分大小，为进一步完善甘草饮片质量评价标准和抗氧化物质基础研究提供了数据支持。

参考文献

[ 1 ] 高晓娟，赵丹，赵建军，等.甘草的本草考证[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（2）：193-198.

[ 2 ] 张耀峰.甘草及其活性成分的药理活性研究进展[J].中医临床研究，2019，11（9）：141-142.

[ 3 ] 赵翾，陈复生，李红良.甘草中天然抗氧化剂的提取工艺研究[J].食品科技，2003（2）：50-52.

[ 4 ] 曹思瑶.基于天然药物-甘草有效成分的功能性化妆品的研制[D].长春：长春中医药大学，2019.

[ 5 ] 李松.甘草酸对人胶质瘤U251细胞的作用及其机制的研究[D].广州：南方医科大学，2014.

[ 6 ] 赵凡凡.甘草对D-gal诱导的大鼠抗衰老作用及基于牛磺酸通路的靶标代谢组学研究[D].太原：山西大学，2018.

[ 7 ] 张泽生，史珅，杨超慧，等.甘草多糖免疫调节作用的研究[J].现代生物医学进展，2008，8（10）：1835-1837.

[ 8 ] 贾世亮，武雪玲，李筱筱，等.甘草中黄酮类物质的功能研究进展[J].北京联合大学学报，2016，30（4）：67-73.

[ 9 ] ZHANG CH，YU Y，LIANG YZ，et al. Purification，partial characterization and antioxidant activity of polysaccharides from Glycyrrhiza uralensis[J]. Int J Biol Macromol，2015. DOI：10.1016/j.ijbiomac.2015.05.060.

[10] 楊豆，张卫波.甘草化学成分及药理作用研究[J].湖南饲料，2017（3）：21-23.

[11] 周倩，王亮，戴衍朋，等.基于GC-MS分析蜜炙对甘草中挥发性成分的影响[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（17）：87-90.

[12] 张浩.HPLC法测定甘草中甘草苷和甘草酸含量[J/OL].临床医药文献电子杂志，2020，7（48）：10、21.

[13] 周燕，王明奎，廖循，等.甘草化学成分的高效液相色谱-串联质谱分析[J].分析化学，2004，32（2）：174-178.

[14] 裴世春，朱俊义，夏广清，等.刺拐棒天然成分的抗氧化活性[J].食品工业，2019，40（3）：172-175.

[15] 赵康宏，严思恩，何英杰，等. HPLC-Q-TOF-MS法分析百合中酚类化合物[J].中成药，2019，41（6）：1445-1450.

[16] 张玉锦，洪小茜.活性氧与心血管疾病关系的研究[J].医学综述，2002，8（4）：212-213.

[17] 李向荣.抗氧化剂和自由基与血清白蛋白相互作用的微量热和谱学研究[D].新乡：河南师范大学，2014.

[18] 胡晓慧，代向东，李来来，等.生甘草与炙甘草的抗氧化能力比较研究[J].天津中医药大学学报，2016，35（2）：114-117.

[19] 郭振宇，张毅，张正锋，等.星点设计-响应面法优化川党参产地加工炮制一体化工艺研究[J].中药新药与临床药理，2019，30（11）：1385-1390.

[20] 丁丽娜，邱亦亦，束彤，等.超高效液相色谱-质谱联用技术解析沙棘果超临界CO2萃取物中黄酮类天然产物结构[J].食品科学，2019，40（18）：273-280.

[21] 王艳萍，薛兴亚，张秀莉，等. HPLC/ESI-MS法鉴定半枝莲乙酸乙酯组分中黄酮苷元类化合物[J].质谱学报，2009，30（3）：129-138.