菊科类青蒿同源四倍体的诱导和根尖染色体鉴定研究

张 宇

(亳州学院，安徽 亳州 236800)

青蒿为菊科艾属一年生草本植物，是我国的传统中药，具有清热解暑、除蒸、截疟和抗菌之功效[1-2]，主要是其体内含有大量的倍半萜内酯活性成分。其中从青蒿植株中提取的青蒿素是市场上供不应求的抗疟消炎药物，长期以来均是依赖于采集野生青蒿进行提取[3]。但是由于生长环境和青蒿自身的原因导致，野生青蒿的分布比较稀疏，植株内的青蒿素含量较低，无法满足现阶段市场的需求[4]。此外，由于不规范的采摘导致野生青蒿越来越稀少，特别是花期前采收导致野生青蒿没有种子传播，严重阻碍了野生青蒿的种子繁殖途径[5]。因此，急需通过生物、化学的手段不断扩大野生青蒿的繁育途径，培育高质量人工繁育植株。为解决这一难题，满足市场需求，国内外学者对青蒿素的生产进行了大量研究，如：细胞悬浮培养[6]、种源筛选[7]和R质粒转化的青蒿发根培养[8]，化学全合成生产青蒿素等[9]。但是，目前有关青蒿育种方面的研究报道甚少，而且已有研究也只是利用化学方法诱导了多倍体，很少有对所得的变异株系做进一步的性状鉴定和化学含量方面的测定[10-11]。多年来，人工诱导多倍体的研究一直吸引着广大植物育种工作者，尤其是多倍体植株具有产量高、抗逆性强和生长活性大等特点。本文以秋水仙碱为诱变剂，考察在不同诱变时间(12h、24h、36h和48h)、诱变浓度(0.2%、0.1%、0.05%)条件下青蒿种子的存活率与诱变。同时，通过比较诱变育苗与未诱变育苗的性状，筛选具有优良性状的品种，为培育高产优质的青蒿优良品种提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

自培育的青蒿(ArtemisiaannuaL.)无菌苗；秋水仙碱为由北京化工厂生产的分析纯试剂；二甲基亚砜、萘乙酸(NAA)、MS培养基和吲哚乙酸(IAA)均生物级试剂，由上海吉至生化科技有限公司提供；丙草胺、盐酸和苯酚为分析纯，由上海麦克林生化科技有限公司提供；实验用水为蒸馏水。

1.2 实验方法

1.2.1 菌苗诱导处理

取生长20d的青蒿无菌苗作为供试材料。切取青蒿试管苗幼芽，用含2%二甲基亚砜(DMSO)及丙草胺(表面活性剂)的不同浓度秋水仙碱溶液(二甲基亚砜，丙草胺及秋水仙碱溶液三者的体积比例为10:1:2000，无菌秋水仙碱浓度梯度：0.2%、0.1%、0.05%)[5]浸泡不同时间(12h，24h，36h和48h)，将处理后仍成活的苗建立株系，以无菌水清洗后转入到最佳繁殖培养基，即MS+6-BA 0.5mg/L+IAA0.1mg/L[6]中扩大繁殖，培养20d后将仍存活的芽建立株系并扩繁，并对芽存活率以及诱导率进行统计。

1.2.2 根尖染色体鉴定

将培养20d的青蒿试管苗，切取带2-3个腋芽的茎段接种在1/2MS+NAA1.0mg/L培养基[5]上诱导生根，待根长至0.2～0.5cm时，切取青蒿根尖，蒸馏水洗三次，随机分组，分别以不同浓度秋水仙碱溶液在10～20℃下预处理不同时间，水洗三次，以清除秋水仙碱残留物，放置冰箱中固定24h，60℃下0.2M HCl水解不同时间，蒸馏水清洗，用改良苯酚品红染色，压片，镜检[12]，并统计诱导率(诱导率=诱导数/处理芽数)。为了进一步提高染色体的鉴定效果和速度，按表1参数进行研究，得到最佳的染色体鉴定方法。

表1 根尖染色体鉴别实验参数

1.2.3 青蒿二倍体与四倍体比较分析

(1)气孔开度

随机选取生长2个月的青蒿各株系(包括对照组，即二倍体株系)，挑取其全展叶片，制作成临时装片，在显微镜下观察并计量，每个株系观察15个视野，随机挑取5个视野，记录气孔的长和宽，比较青蒿二倍体植株与四倍体植株的气孔开度大小。

(2)试管苗形态

对生长2个月的各株系进行形态学比较，比较项目包括①株高：主茎基部至顶梢的总长；②叶面积：叶长×叶宽；③茎粗：测定植株中部主茎的直径。其中，测量叶面积时，要挑选各植株相同部位的叶片，本实验中统一选取植株中部的叶片。各个株系都随机选取10株试管苗，求取平均值。

2 结果与分析

2.1 青蒿多倍体诱导的实验结果

在本实验中，多倍体诱导克服了自然状态下青蒿素普遍含量低，且不稳定，受地理环境采集时期、采集部位、气温和施肥等因素的影响，品质不易控制等因素的限制，可以培育出含量高且稳定的新品种，可以提高青蒿素含量及加快繁育周期。秋水仙碱溶液诱导青蒿同源四倍体的方法及结果见表2。

表2 不同浓度秋水仙碱浸泡不同时间对青蒿多倍体诱导的影响

如表2所示，秋水仙碱对青蒿苗的诱导效果和浓度、浸泡时间有直接关系：当秋水仙碱浓度小于0.1%且浸泡时间小于24h时，青蒿苗的存活性呈正相关关系；当秋水仙碱浓度大于0.1%和浸泡时间大于24h时，青蒿苗的存活性呈负相关关系。当秋水仙碱浓度为0.2%、浸泡时间24h时，青蒿苗诱导率最大达36%，成活率为36%，因此该条件为青蒿试管苗的最佳诱导条件。

2.2 青蒿根尖染色体鉴定结果

植株细胞染色体的倍数是表征遗传变异育种的重要方法之一。通过用0.2%的秋水仙碱浸泡，更有利于使分裂细胞的染色体缩短、分散，从而便于观察。而通过解离，使细胞之间的连接破坏，到后来压盖玻片的时候可以把细胞散开，不至于一个摞一个看不清单个细胞的形态。经过反复试验与比较，最终确定用于青蒿根尖染色体鉴定的最佳流程为：早8点切取根尖，先用0.2%的秋水仙碱浸泡3h，再以卡诺氏固定液固定2h，解离后压片镜检，共获得8个多倍体株系，其中四倍体和二倍体试管苗根尖染色体结果如图1所示。青蒿二倍体根尖染色体数目2n=18条，四倍体根尖染色数目2n=36条。

(a)二倍体(2n=2x=18)

(b)四倍体(2n=4x=36)

2.3 青蒿二倍体与四倍体植株气孔比较

为了验证比较诱变植株和原植株的光合作用，进行叶片气孔的形态、大小等特征分析[6]。因为叶片气孔是连接外界环境的重要通道，承担着水分和气体的有效运输任务，与植株的抗逆性有着重要的相关性[7]。在本实验中，以原二倍体植株作为对照组，记为CK。其余诱导得到的各株系分别记为A、B、C。将部分植株测量、处理后得出的数据见表3。显微镜下观察二倍体及四倍体试管苗气孔差异，具体见图2。

表3 青蒿部分二倍体与四倍体试管苗气孔结果

(a)二倍体

(b)四倍体

通过表3可以明显的发现，多倍体株系气孔的长度和宽度，明显的大于对照组二倍体植株，结合图2，我们也可以直观的看到，青蒿四倍体植株的气孔开度大于二倍体植株。由表3可知，统计得到A1-2株系的气孔平均长度及平均宽度大约为对照组的2.90、4.19倍。由上，可推断四倍体植株相对于二倍体植株，能更好的进行水分和气体的交换，更高效率的进行光合作用，从而有利于育种。

2.4 青蒿二倍体与四倍体试管苗形态的比较

试管苗二倍体与四位体性状比较图如图3所示。

将原二倍体植株作为对照组，记为CK。部分植株比较的具体数据，见表4。

表4 试管苗二倍体与四倍体性状比较

二倍体植株生长正常，而四倍体植株生长缓慢。由表4可以明显看出，多倍体植株在株高、叶面积以及茎粗方面相对于二倍体植株都发生了变化。结合图3，看出二倍体植株叶片较薄，正常绿色，边缘略向上翘，叶脉突起不明显，节间较长；而四倍体植株的叶片增厚，呈深绿色，边缘略下卷，叶脉明显突起，节间缩短，茎粗壮。诱导得到的青蒿四倍体在试管苗阶段已经表现出茎粗壮，叶片宽大等多倍体的巨型性特征，预示了其在田间生长的趋势。

3 结论

为构建高产量优质青蒿植株品种体系，本文采用化学诱导育种方法考察青蒿同源四倍体的诱导，为遗传育种提供了选育优良品种的一种方法。通过添加具有提高细胞壁的透性的二甲基亚砜和保持细胞表面湿润性的丙草胺混合溶液，促进秋水仙碱进入植物组织。青蒿试管苗的最佳诱导条件为：秋水仙碱浓度为0.2%、浸泡时间24h时，青蒿苗诱导率最大达36%，成活率为36%。根据根尖染色体进行了鉴定结果显示，多倍体植株在株高、叶面积以及茎粗方面相对于二倍体植株均具有明显优势，鉴定出8个性状优良的四倍体株系为A1-1、A1-2、A2-10、A2-2、B4-1、B4-2、C1-1、C1-2。