喷施赤霉素对“三青”莴笋生长、光合电子传递和氰化物含量的影响

张泽锦,王力明,梁 颖,李跃建,唐 丽*

(1.四川省农业科学院园艺研究所,蔬菜种质与品种创新四川省重点实验室,四川 成都 610066; 2.农业农村部西南地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,四川 成都 610066; 3.四川省农业科学院,四川 成都 610066)

【研究意义】莴笋是莴苣六大栽培类型之一，为菊科一、二年生蔬菜，以肥大的肉茎为食用器官的一类蔬菜，在中国有着悠久的栽培历史[1]，在我国南方地区广为栽培[2]。莴笋是四川高山地区夏季种植的主要错季蔬菜，以川西面积最大。其中，四川阿坝藏族羌族自治州夏季莴笋播种面积在0.53万hm2，5月中下旬至10月上旬上市，正好填补了四川平坝丘陵区夏季叶菜“淡季”，市场行情好，种植户经济效益可观。“三青”莴笋(LactucasativaL.var.angustanaIrishex Bremer)因其具有青皮、青肉、青叶而得名，其营养丰富，皮薄肉厚，质脆嫩，味清香，深受消费者喜爱，但是，“三青”莴笋因其品种特性，自然生长过程中常存在节间距短、植株矮小、茎杆短、商品性差的问题。在实际生产上常通过赤霉素(GA3)处理来提高莴笋节间和株高，但是其具体机理和安全性尚不明确。本试验通过喷施不同浓度的GA3，研究了GA3对莴笋不同时期株高和茎粗的影响；通过转录组测定，揭示了GA3对莴笋光合电子传递性能、氰化物含量的作用机制。【前人研究进展】GA3是一种重要的植物激素，它参与了植物生长发育的全过程，其生理作用多种多样，可以打破某些植物的休眠、促进茎秆伸长、叶片伸展、种子萌发、开花、果实发育等[3]。国内外已有大量文献报道了外源GA3处理对蔬菜生长和产量的影响。例如，Kuchlan等[4]研究发现，喷施GA3提高了大豆株高，增加了籽粒产量。叶倩等[5]研究结果显示，60 g/hm2GA3喷施苋菜，能显著增加苋菜株高和产量。邓惠惠等[6]研究表明，喷施GA3会促进黄瓜植株茎的伸长和增粗。【本研究切入点】在四川，外源GA3被广泛用于提高“三青”莴笋株高和茎粗来提升商品价值，但有关研究鲜有报道。【拟解决的关键问题】明确GA3对“三青”莴笋生长、光合作用及氰化物含量的影响机制，为“三青”莴笋高效安全生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以“三青”莴笋(LactucasativaL.var.angustanaIrishex Bremer)为供试材料，品种为西龙高山青，购自四川广汉龙盛种业有限公司。GA3为分析纯，购自成都市科隆化学品有限公司。

1.2 试验设计

试验于2020年9—12月在四川省农业科学院现代农业科技创新示范园内进行。2020年9月2日，选择大小均匀且饱满的西龙高山青莴笋种子进行浸种、催芽，待种子露白后播种于50孔育苗盘中育苗。2020年9月25日，挑选大小一致的莴笋幼苗定植于示范园大田小区中，小区长2.0 m，宽1.5 m，每个小区种植15株，行距30 cm，株距30 cm，定植前施足基肥。当莴笋幼苗5～6片叶展开时于10月21日早上9点喷施不同浓度的GA3。试验共设5个处理，分别为喷施12.5 mg/L(T1)、25 mg/L(T2)、50 mg/L(T3)、100 mg/L(T4)GA3溶液，喷清水T0(CK)为对照，以叶片滴水为度。每个处理随机排列，重复3次。生长期间常规管理。

1.3 项目测定及方法

1.3.1 生长指标测定 分别在10月21日、11月1日、11月11日、11月21日及收获时间11月25日进行株高和茎粗测量。株高采用刻度尺测量，茎粗采用游标卡尺测量。

1.3.2 叶绿素荧光测定 11月21日利用双通道荧光仪Dual-PAM-100(Walz，德国)自动测量程序，在叶片暗适应180 min后测定喷施GA3(50 mg/L)和未喷施GA3(CK)莴笋中部叶片快速叶绿素荧光诱导动力学曲线，JIP-test参数根据Strasser等(2000)计算得到[7]。

1.3.3 转录组分析 11月25日采收莴笋，取喷施GA3(50 mg/L)和未喷施GA3(CK)莴笋茎尖，将样品放入液氮中速冻，保存于-80 ℃备用，每个处理取3个样用于转录组分析。样品的后续处理包括RNA抽提、纯化、建库以及采用第二代测序技术(Next-generation sequencing,NGS)，基于Illumina测序平台，对这些文库进行双末端(paired-end,PE)测序，并对相关基因进行qRT-PCR验证(参考基因组：Lsat_Salinas_v7；下载链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_002870075.1/)。以上工作由上海派森诺生物有限公司完成。

1.3.4 氰化物测定 11月25日采收莴笋，参照食品安全国家标准 食品中氰化物的测定(GB 5009.36—2016)第一法进行测定，以氢氰酸含量表示氰化物含量。

1.4 数据分析

本试验所有数据用Excel 2013 进行整理，用SPSS 20.0 进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，差异显著性检验采用 Duncan 新复极差法。

2 结果与分析

2.1 不同浓度GA3处理对“三青”莴笋株高的影响

由表1可知，喷施GA3当天莴笋株高各处理间无显著差异。之后每10 d测定莴笋株高，直至收获。11月1日，喷施GA3均增加了莴笋株高，其中T2、T3和T4处理莴笋株高均显著高于CK，分别增加了44.12%、50.61%和55.07%，但是三者间无显著差异。在11月11日，莴笋株高变化趋势与11月1日一致，T1与CK无显著差异，其余处理均显著高于CK，但是T3处理莴笋株高最大，为30.50 cm，较CK增加了28.15%。在11月21日和11月25日时，与CK相比，GA3处理莴笋株高均显著增加，11月21日莴笋株高分别增加了19.98%、47.63%、50.10%以及54.48%，11月25日莴笋株高分别增加了16.22%、41.51%、43.16%以及55.52%。

表1 喷施GA3对“三青”莴笋株高的影响

2.2 不同浓度GA3处理对“三青”莴笋茎粗的影响

由表2可知，在11月1日、11月11日和11月21日，喷施不同浓度GA3均增加了莴笋茎粗。在11月1日，与CK相比，各处理(T1、T2、T3和T4处理)莴笋茎粗分别增加了7.45%、17.16%、45.03%以及40.92%。在11月11日，与CK相比，各处理莴笋茎粗分别增加了1.71%、10.50%、21.19%以及20.60%。在11月21日，与CK相比，各处理莴笋茎粗分别增加了6.12%、7.99%、11.68%以及8.26%。

2.3 GA3处理对“三青”莴笋叶片光合电子传递性能的影响

表3～4显示，GA3处理对叶片PSⅡ反应中心能量分配和光合性能指标的影响。喷施GA3，单位活性反应中心吸收的光能(ABS/RC)、捕获的光能(TRo/RC)、用于电子传递的能量(ETo/RC)和热耗散的光能(DIo/RC)显著增加，相比对照分别增加2.6%、2.5%、4.7%及4.9%。最大光化学效率(φPo)与对照无显著差异；光合反应中心数目(RC/ABS)、2 ms时有活性的反应中心的开放程度(Ψo)及以吸收光能为基础的光合性能指数(PIABS)均显著增加，相比对照分别增加2.5%、2.3%及9.2%。由此可见喷施GA3通过提高PSⅡ光合反应中心吸收和捕获光的能力和PSⅡ向下游传递电子的数量，最终提高了莴笋叶片光合电子传递效率。

2.4 GA3处理对“三青”莴笋氰化物含量的影响

由图1可知，喷施GA3增加了莴笋茎秆氰化物的积累。喷施50 mg/L GA3时，“三青”莴笋氰化物含量为0.583 mg/kg，显著高于CK。与CK相比，增加了112.77%。

表2 喷施GA3对“三青”莴笋茎粗的影响

表3 喷施GA3对“三青”莴笋叶片光合电子传递性能的影响

表4 喷施GA3对“三青”莴笋叶片光合电子传递性能的影响

2.5 GA3处理对莴笋光合电子传递和氰化物影响的转录组分析

喷施GA3后，莴笋有显著差异的代谢通路有14个(图2)，其中光合作用(Photosynthesis)和氰基氨基酸代谢(Cyanoamino acid metabolism)途径是其中2个。光合作用(Photosynthesis)途径中LOC111897400(psbS)、LOC111897632(petH)、LOC111895461(petC)、LOC111890958(ATPF1G,atpG)、LOC111905179(psbQ)、LOC111903099(psbQ)基因上调；氰基氨基酸代谢途径中LOC111895989(丝氨酸羟甲基转移酶)、LOC111879508((R)-扁桃腈裂解酶)及LOC111910046(β-葡萄糖苷酶)3个基因上调。

2.6 GA3处理对莴笋光合电子传递和氰化物影响的qRT-PCR验证

为了验证RNA-seq的结果，对以上2个途径中的8个上调的差异基因进行qRT-PCR验证(图3)。

喷施GA3后，光合作用代谢途径中LOC111897400(psbS)、LOC111897632(petH)、LOC111895461(petC)、LOC111890958(atpG)和LOC111903099(psbQ)5个基因相对表达量分别增加148%、182%、145%、166%及224%；氰基氨基酸代谢中LOC111895989(丝氨酸羟甲基转移酶)、LOC111879508[(R)-扁桃腈裂解酶]及LOC111910046(β-葡萄糖苷酶)3个基因相对表达量分别增加152%、632%及246%。结果说明，转录组数据可以表征喷施GA3后莴笋光合作用和氰基氨基酸代谢中转录水平的变化情况。

3 讨 论

GA3参与调控种子萌发、茎秆伸长、成花转变及花和果实的发育等过程。GA3在植物体内中的细胞质中主要由GA3氧化酶(GA3ox2)和GA2氧化酶(GA20ox)催化GA12成为较高生物活性的GA3GA1和GA4，对植物表型产生作用[8]。GA3可以诱导水稻[9]、大豆[10]、油菜[11]、甘蔗[12]等植物的的节间伸长。外源喷施GA3被植物直接吸收利用，增加莴笋茎干中细胞分化和拉伸，最终增加莴笋的株高和茎粗。

喷施GA3对不同作物的光合能力影响不同，喷施20 mg/L GA3可明显提高冬枣叶片净光合速率、蒸腾速率和气孔导度[13]。喷施4.0 mg/L GA3能显著影响凤梨释迦的叶片叶绿素荧光特性，提高PSⅡ有效光化学量子产量[14]。GA3处理后葡萄叶绿素荧光参数Fm、Fv/Fm和ETR 出现不同程度的降低，NPQ 较对照显著升高[15]。喷施GA3后，莴笋叶片有关电子传递途径上调控基因显著上调。LOC111897400(psbS)调控光系统Ⅱ22 kDa蛋白(photosystem II 22 kDa protein)的表达，PsbS蛋白是PSⅡ处结合叶绿素结合蛋白[16]。PsbS蛋白在能量耗散中起着关键性的作用，这对于可变条件下，调节植物处于合适光合状态至关重要[17]。过量表达PePsbS1和PePsbS2的转基因拟南芥均显示出增强的光保护作用[18]。LOC111897400(psbS)基因的上调表达，说明喷施GA3后提高了莴笋叶片自身光保护能力。LOC111895461(petC)调控细胞色素b6/f复合体，该复合体在调节电子传递链的电子流向和PSII与PSI之间的状态转移等光合过程中起到关键的作用[19]。LOC111895461(petC)的上调使得电子顺利通过细胞色素b6/f复合体进入PSⅠ。光合电子传递中的铁氧还蛋白NADP+氧还酶(FNR)则受LOC111897632(petH)的调控，在两种桑树的研究中表明，Morus002073(petH)基因上调的会导致该品种的光合速率的增高[20]。喷施GA3后，导致莴笋LOC111897632(petH)的上调表达，则可以生成更多的NADPH，用于光合作用中的碳固定。LOC111890958(atpG)调控ATP合成酶，LOC111890958(atpG)上调表达，使更多的氢离子通过ATP合酶泵出细胞膜外，同时产生更多的ATP用于光合作用的能量。光合电子传递链上有关基因的上调表达，导致莴笋叶片电子传递吸收、捕获光的能力及PSⅡ向下游传递电子的数量提高，最终表现出吸收光能为基础的光合性能指数(PIABS)增高。

植物自身就能合成氰化物，木薯、杏仁、竹笋等植物中就含有不同浓度的氰化物[21-23]，以含氰糖苷(cyanogenic glycoside)形式存在[24]。目前已发现50多种生氰糖苷类物质存在于植物体内[25]。外界环境的改变能提高植物体内氰化物含量，如干旱可以使得高粱牧草中的氰化物含量增高[26]。喷施GA3后，莴笋体内的氰氢酸是通过R-苯乙醇腈(R-mandelonitrile)经过R-扁桃腈裂解酶(LOC111879508)生成；喷施GA3后，R-扁桃腈裂解酶(LOC111879508)表达显著上调，所以使得氰氢酸生成增多。此外，在氢氰酸代谢途径中，丝氨酸羟甲基转移酶(LOC111895989)和β-葡萄糖苷酶(LOC111910046)基因表达上调，可能分别使得代谢下游产物(s)-4-羟基扁桃腈[(s)-4-hydroxy mandelonitrile]、2-羟基-2-甲基丁腈(2-hydroxy-2-methyl-butanenitrile)、2-羟基-2-甲基丙腈(2-hydroxy-2-methyl-propanenitrile)及d-扁桃腈葡糖苷(prunasin)、甘氨酸(Glycine)增多，间接的导致氰氢酸的生成。喷施GA3后，“三青”莴笋氰化物含量增高，但是人类肝脏中硫氰酸酶可减轻氰化物的毒性作用[27]；含氰糖苷类物质并不稳定，易在酸性和加热的条件下，自然分解或通过酶解产生有毒的HCN气体[28]。Cardoso 等[29]设置氢氰酸对健康造成危险的浓度是高于100 mg/kg，本次测定的“三青”莴笋品种可食部分氢氰酸含量低于此浓度，未对健康造成危险，但还需开展更多“三青”莴笋品种的相关研究，对四川栽培过程中大面积应用赤霉素拔节“三青”莴笋的方法的进行安全性评价。

4 结 论

(1)喷施不同浓度的GA3均增加了“三青”莴笋的株高和茎粗，喷施100 mg/L GA3，“三青”莴笋株高最大，喷施50 mg/L GA3，“三青”莴笋茎粗最大，两者间无显著差异，在生产中可根据实际情况选用相对应的赤霉素浓度对“三青”莴笋进行喷施。

(2)对比喷施GA3(50 mg/L)和不喷施GA3(CK)2个处理，喷施GA3显著提高了“三青”莴笋的光合性能和氰化物含量，这是由于喷施赤霉素后，“三青”莴笋的光合作用代谢途径中LOC111897400(psbS)、LOC111897632(petH)、LOC111895461(petC)、LOC111890958(atpG)和LOC111903099(psbQ)和氰基氨基酸代谢中LOC111895989(丝氨酸羟甲基转移酶)、LOC111879508((R)-扁桃腈裂解酶)及LOC111910046(β-葡萄糖苷酶)的相对表达量增加而导致。