日粮精粗比对育肥藏羊肠道真菌多样性的影响

李蒋伟，周 力，侯生珍，王志有，雷 云，贾建磊，桂林生

(青海大学农牧学院，青海 西宁 810016)

【研究意义】肠道微生物对机体健康的影响机制是近年来研究的一大热点，真菌在肠道菌群中相较于细菌占比较小，但是对维持肠道生态平衡发挥了重要作用[1]。目前肠道真菌与宿主间的互益关系并未有力证据被证明，而除了少数具有益生作用的真菌之外，肠道真菌多为致病菌，大量学者研究表明肠道真菌对炎症性肠病、腹泻等疾病有重要影响[2-4]。但对于反刍动物来说，真菌有利于挖掘高效纤维降解酶，而畜种、消化道类型和日粮结构等因素均能影响消化道真菌的组成。许多研究者发现草食动物消化道中存在大量好氧真菌,无论这些真菌是一过性还是长期定殖,它们在消化道中都行使了一定的纤维消化功能，且酵母纲所占比例高,具有潜在开发价值[6-8]。【前人研究进展】ISHAQ等[9]利用WHITE等[10]的引物扩增ITS1序列,通过高通量分析发现在奶牛瘤胃中存在着近50%的非严格厌氧真菌；当奶牛日粮精粗比升高诱导亚临床酸中毒后,奶牛瘤胃中新美鞭菌属、根囊鞭菌属、梨囊鞭菌属厌氧真菌的相对丰度显著降低，而翘孢霉属 (Emericella) 、镰刀菌属 (Fusarium) 、红曲霉属(Monascus) 、毕赤酵母属 (Pichia) 、假丝酵母 (Candida) 等相对丰度有增加趋势。【本研究切入点】ITS高通量测序技术利用其在不同菌种中序列的多样性进而鉴定菌种的类别[11]，而使用高通量测序技术测定不同精粗比日粮对藏羊肠道真菌微生物菌群分布鲜有报道。【拟解决的关键问题】本试验旨在探究早期断奶藏羔羊育肥期日粮适宜的精粗配比，测定藏羊肠道真菌微生物分布特征，分析不同精粗比真菌菌群定植的影响，为藏羊日粮的合理配制和科学饲养提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间和地点

2019年5月15日至8月25日，在青海省海南州共和县切吉乡哇合村青海香咔梅朵牧业有限公司进行动物饲养试验；2019年9月16日肠道食靡样品交由百迈克生物科技公司进行真菌16S rDNA基因的测序工作。

1.2 试验设计及饲养管理

选择健康、体况相近的早期断奶藏羊母羔共210只，随机分成7组，每组30只。7组羔羊分别饲喂精粗比为80∶20(A组)、70∶30(B组)、60∶40(C组)、50∶50(D组)、40∶60(E组)、30∶70(F组)和20∶80(G组)的日粮；日粮精粗比为干物质比，各组精饲料完全一致，粗饲料由燕麦青干草与燕麦青贮按干物质比例1∶1混合而成。饲养试验预饲期为10 d，正试期为90 d。藏羊未有现行饲养标准，参考NY/T 816—2004中国肉羊饲养标准[12]进行日粮配制，精饲料组成及营养水平如表1。

1.3 饲养管理

试验羔羊全舍饲分栏饲养，分别于早晨8：30和下午16：30饲喂羔羊2次，日粮自由采食，自由饮水，每天饲喂前清扫残留饲料并称重。每天中午12：30定期清扫羊舍，保持羊舍卫生、通风和干燥，每周对羊舍和运动场进行2次消毒杀菌。试验期对羔羊进行羊四联、小反刍兽、口蹄疫和羊痘等疫苗的免疫注射，分别用伊维菌素和溴氰菊酯淋浴进行内外寄生虫防治。

表1 精饲料组成及营养水平

1.4 肠道食靡采集与真菌分析方法

饲养试验结束后，每组中随机抽取3只试验羊于清晨空腹屠宰，采集小肠食靡于5 mL离心管中，混匀、过滤后将滤液进行3500 r/min离心15 min，投入液氮，于实验室-80 ℃冷冻保存。本试验16SrDNA高通量测序部分交由百迈客生物科技有限公司测定，对采集到的21个肠道食靡样品基于 Illumina HiSeq测序平台，采用双末端测序(Paired-End)的方法，构建小片段文库进行测序，进一步对 Reads 拼接过滤，OTUs聚类分析，物种注释及丰度分析。使用DNA提取试剂盒(InvitrogenTM，USA)提取瘤胃微生物基因组DNA，根据保守区设计得到引物，真菌通用引物为ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′ ITS2：5′-GCTGCGTTCTTCATC GATGC-3′。在引物末端加上测序接头，进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库进行高通量测序，进而得到原始图像数据文件。PCR扩增步骤为：模板DNA经加热至98 ℃左右持续 2 min，轮回30次循环，依次经过98 ℃×30 s、50 ℃×30 s、72 ℃×1 min，最后于72 ℃下延长7 min。

1.5 数据处理

采用Excel整理初始数据，用SPSS 20.0中的One-way ANOVA进行单因素方差分析，检测结果用平均值±标准误(Mean±SE)的形式表示。差异显著的评断标准为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 日粮精粗比对育肥藏羊肠道真菌微生物的影响

2.1.1 测序数据质量评估 参与测序21个育肥藏羊肠道食靡样品共产生1524 066条Clean tags，每个样品至少产生67 257条Clean tags，平均产生72 575条Clean tags。所有样品测序覆盖率均在99%以上，本试验测序深度能够准确反映藏羊瘤胃细菌的组成。

从图1可以看出，在97%的物种相似度水平下，7组检测样本共得到499个OTU，其中有351个为7组共有OTU，占OTU总数比例的70.3%，独有的OTU分别为12、15、10、11、76、6和18个，占总的OTU数较小，表明各组之间(除E组外)OTU组成差异较小，相似度较高；其中E组肠道真菌特有OTU最高，有76个；G组次之，有18个；F组特有OTU最少，有6个。

Rank-Abundance曲线可解释7组样品多样性的丰富程度和均匀程度，在横轴上的宽度代表物种丰富程度，曲线的形状则表示物种的均匀程度，曲线平坦，表示样品中肠道真菌微生物均匀度较高。如图2可以看出，每条曲线对应一个样品，用不同颜色标记。E组曲线最宽，C组最窄，各组曲线平坦程度相当。

2.1.2 日粮精粗比对真菌阿尔法多样性的影响 Alpha多样性分析可以反映测定样品瘤胃微生物群落丰富度和多样性，其中Chaol指数和ACE指数越大表明群落丰富度越大；Simpson指数越大反映群落多样性越低；Shannon指数越大群落多样性越高。由表2可知，E组Shannon指数显著高于B、C组(P<0.05)；B、C组Simpson指数显著高于其余各组(P<0.05)；B组ACE指数显著高于其余各组(P<0.05)；Chaol指数中F组显著高于其余各组(P<0.05)。

2.2 不同精粗比日粮对藏羊肠道真菌分布的影响

2.2.1 门水平下真菌分布分析 由表3可知，子囊菌门是各处理组的优势菌门，占肠道真菌比例超过34%，且C、D和F组显著高于A、B组(P<0.05)；担子菌门是次优菌门，且B组显著高于其余各组(P<0.05)；被孢霉菌门A、B组显著高于其余处理组(P<0.05)；捕虫霉亚门各组之间无显著性差异(P>0.05)。

表2 阿尔法多样性指数表

表3 门水平下真菌相对含量

2.2.2 科水平下肠道真菌菌群分布分析 由表4可知，被孢霉菌科为藏羊肠道真菌中优势菌科，最高占比超过18%，且A、B组中占比较高(P<0.05)；丝孢酵母菌科C、D组显著高于其余各组(P<0.05)；黏毛菌科则在低精料处理组(F和G组)中分布较广(P<0.05)；酵母菌科则B组显著高于其余各组(P<0.05)；G组中红菇科相较其他处理组有较多分布(P<0.05)。

3 讨 论

3.1 日粮精粗比对藏羊肠道真菌丰度的影响

许多学者研究表明，真菌在肠道所占比例较小，但对于肠道菌群稳态平衡至关重要[13]。肠道菌群通过影响某些营养素、激素和维生素的合成和代谢，通过清除药物和有毒代谢物，为维持宿主健康作出了巨大贡献；除此之外，真菌还可以通过促进宿主免疫系统中免疫细胞的发育和成熟来抵御病原体[14-15]。除此之外，肠道真菌同细菌关系紧密，它们稳定的拮抗、互利共生等关系是肠道微生物处于稳态平衡的根本。有学者运用ITS1序列，对以牛科、鹿科和长颈鹿科等为代表的反刍动物与袋鼠科、伪反刍动物骆驼科和河马科前胃发酵非反刍动物，以及马科、美洲鬣蜥科和犀科等后肠发酵动物(共29种)的粪便中厌氧真菌组成进行了系统比较，发现厌氧真菌的OTU数在4种发酵类型的动物粪便中无显著差异，但在后肠发酵动物粪便中的厌氧真菌组成明显有别于前胃发酵类型[16]。本试验对藏羊饲以不同精粗比的日粮后发现，当精粗比为40∶60时，肠道真菌OTU数量最多，而其余处理组OUT数量差别不大，且真菌群落丰富度与多样性与其他处理组相比均较好；试验结果表明，对藏羊日粮中添加适量的粗饲料可以有效促进其肠道真菌定植与代谢。

3.2 日粮精粗比对藏羊肠道真菌物种分布的影响

通常认为，反刍动物消化道门水平下真菌具有解聚复杂分子结构的能力，例如降解木质纤维素生物量、提高动物饲料消化率、生产沼气、生物乙醇和其他各种功能[17-19]。Avijit Dey等[20-21]给反刍动物直接饲喂厌氧真菌培养物发现，厌氧真菌可以提高其采食量、乳质量和乳产量等。近年来，许多学者利用真菌通用引物在反刍动物消化道内发现和报道了越来越多的非严格厌氧真菌，其中包括子囊菌门、担子菌门和接合菌门等，瘤胃中子囊菌门相对丰度更高，可高达22.6%[22]。本研究结果发现子囊菌门、担子菌门在藏羊肠道也广泛存在，且丰度分别超过了34%和8%；除此之外被孢霉菌门的相对丰度在藏羊肠道中也不可忽视，丰度超过4%；说明日粮精粗比例并不会改变藏羊肠道优势菌群种类，但对其丰度有较大影响。

表4 科水平下真菌相对含量

酵母菌是具有庞大的家族系统的兼性厌氧型真菌，种类达1000多种，是子囊菌门中的重要成员，其培养物作为一种安全环保的饲料添加剂，受到饲料生产者和研究者的重视；大量研究表明饲喂活酵母可促进瘤胃微生物数量和活力，改善产肉和产奶性能[23]。Williams PE等[24]研究表明,高精料日粮饲喂奶牛，活酵母可以加速瘤胃乳酸代谢，调控瘤胃pH值至稳定状态；除此之外，饲喂活酵母可改善瘤胃的发酵特性，增强瘤胃微生物对纤维饲料的定殖，进而提高微生物对纤维饲料的降解能力[25]。寇慧娟[26]在研究酵母培养物对羔羊的影响发现，饲粮中添加20 g/kg酵母培养物可以显著提高羔羊瘤胃内羧甲基纤维酶活性，同时促进羔羊瘤胃发育，也有利于维持瘤胃乳头的正常形态，在高精料饲粮中效果更为明显。李娜等[27]研究表明舍饲条件下滩羊羔羊瘤胃中酿酒酵母的含量高于放牧组羔羊，说明增加精料比例可以促进酿酒酵母在2月龄滩羊瘤胃内的定植。本试验研究发现，当精粗比为70∶30时，酵母菌科相对丰度远高于其他处理组，而其余处理组之间酵母菌科相对丰度无较大差距。

4 结 论

在本试验条件下，藏羊肠道优势菌群为子囊菌门和担子菌门；当日粮精粗比例为40∶60时，藏羊肠道真菌微生物多样性及丰富度较好；适量的精料可促进酵母菌科生长，精粗比在70∶30时酵母菌科相对丰度最高，但过高的精粗比例会抑制该菌生长。综合上述结果，精粗比为40∶60时更适合藏羊肠道真菌定植及结构构建。