不同生长阶段大口黑鲈肠道微生物多样性研究

2021-02-12余凤琴陈元坤陈红霖王恕桥

西南农业学报 2021年12期

但言，余凤琴，李双，陈元坤，陈红霖，李燕，王恕桥

(重庆市水产科学研究所，重庆 401120)

【研究意义】肠道是鱼类重要的消化和吸收器官[1]，肠道微生物存在于肠道壁、肠道黏膜及其内容物中[2]，是鱼类肠道的重要组成部分，对鱼类提供屏障、促进营养吸收、提高免疫具有重要作用[1]。鱼类生长发育过程中肠道菌群结构会发生变化[3]。【前人研究进展】目前，肠道微生物的研究主要集中在不同环境[4-5]及疾病条件[6-7]下肠道微生物的差异、变化。【本研究切入点】采用高通量测序技术对大口黑鲈不同生长阶段肠道微生物结构及多样性进行分析。【拟解决的关键问题】为大口鲈肠道微生态研究、鲈养殖技术改良、益生菌筛选、疾病预防提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 实验动物及其养殖

实验用鱼为大口黑鲈(Micropterussalmoides)，养殖在重庆市水产科学研究所长寿湖基地池塘中。实验用鱼苗均为2019年孵出，当年4月份购入并放入池塘，其间每日投饵2次(8:30、16:00)，饲料为鲈鱼专用商品饲料(粗蛋白≥50%，粗脂肪≥8%，粗灰分≤16%)，日投喂量为初始体重的3%～5%，并根据摄食情况随时调整。

1.2 样品采集

共采集有效样品33个，第一次采集为5月龄(2019年8月，A组)，之后根据实际情况采集6月龄(2019年9月，B组)，7月龄(2019年10月，C组)，9月龄(2019年12月，D组)，10月龄(2020年1月，E组)，12月龄(2020年3月，F组)，14月龄(2020年5月，G组)，15月龄(2020年6月，H组)，16月龄(2020年7月，I组)，共采集9组，每次下午采集大口黑鲈肠道去除内容物置于5 mL冻存管中，置于-80 ℃的冰箱中保存待测。

1.3 DNA提取及16S rDNA高通量测序

样品送至深圳微生太科技有限公司，根据E.Z.N.A.®soil试剂盒说明书进行总DNA抽提；用338F和806R引物对V4可变区进行PCR扩增，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit对回收PCR产物进行纯化，洗脱后利用QuantiFluorTM-ST进行检测定量。根据Illumina MiSeq平台标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2×300的文库。利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序。

1.4 测序结果分析

对原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据，基于有效数据进行OUTs聚类和物种分类分析，并将OUT和物种注释结合，从而得到样品的OTUs和分类谱系的基本分析结果。再对OTUs进行丰度及多样性分析，同时将物种注释在各个分类水平上进行群落结构的统计分析，并以LEfSe分析组间菌群差异。

2 结果与分析

2.1 不同生长阶段大口黑鲈肠道微生物的α多样性差异分析

各组大口黑鲈肠道微生物多样性数据见表1，结果表明，5、6月龄OTU数量，Chao1指数，Shannon指数和Simpson指数均高于其他月龄，在6月龄(B组)均为最大，说明此阶段大口黑鲈肠道微生物多样性最高。

2.2 不同生长阶段大口黑鲈肠道微生物种类组成差异分析

测得序列经过鉴定，在门水平上相对丰度大于2%的有9门。A组优势菌群为厚壁菌门(Firmicutes，40.78%)，B～F组的优势菌群为变形菌门(Proteobacteria)，G～I组的优势菌群为梭杆菌门(Fusobacteria)。随着养殖时间的推移，变形菌门在A～D组呈现出增加趋势，随后上下波动；梭杆菌门在A～D组呈现降低的趋势，在E～H组升高，随后降低；厚壁菌门在A～E组呈现降低的趋势，随后波动(表2)。

各生长阶段大口黑鲈肠道微生物在属水平上相对丰度大于2%的有17属。其中A组的优势种群为消化链球菌科(Peptostreptococcaceae，29.88%)，B、D组优势种群为欧文氏菌属(Erwinia，15.76%)，C、E组的优势种群为支原体属(Mycoplasma，35.24%)，D、E组优势种群为假单胞菌属(Pseudomonas)，G～I组优势种群为鲸杆菌属(Cetobacterium)。随着时间推移，鲸杆菌属占比呈先降低后升高再降低的趋势，后期丰度大幅度提高；假单胞菌属所占比例表现出A～E组升高后升高降低交替变化的趋势。支原体在A～C组所占比例升高，D～E组降低，F～I组降低升高交替变化，邻单胞菌属(Plesiomonas)为G～I组肠道特有，拉恩氏菌属(Rahnella)及肉食杆菌属(Carnobacterium)为D～E组特有，欧文氏菌属(Erwinia)在A和I组没有分布(表3)。

表2 大口黑鲈肠道微生物样品中主要门类所占比例

表3 大口黑鲈肠道微生物样品中主要属类所占比例

续表3Continued table 3

从属水平物种表达谱热图(图1,见封三)可以看出，大口黑鲈肠道微生物主要聚为两大分支，多数B组和E、F、G、H、I组聚为一支，A组、C组及D组聚为一支，说明不同生长阶段大口黑鲈肠道微生物组成差异明显。鲸杆菌属(Cetobacterium)、邻单胞菌属(Plesiomonas)和腐败希瓦氏菌属(Shewanella)在B、E、F、G、H、I组中的丰度明显高于A、C、D组；而支原体属(Mycoplasma)、假单胞菌属(Pseudomonas)和欧文氏菌属(Erwinia)则相反。

2.3 不同生长阶段大口黑鲈肠道微生物的菌群丰度差异分析

通过LEfSe分析组间菌群差异，结果显示(图2,见封三)，A组标志微生物(与其他生长阶段丰度差异显著)为蓝细菌门(Cyanobacteria)、栖热菌门(Thermi)，B组标志微生物为披毛菌科(Gallionellaceae)，C组标志微生物为肠球菌科(Enterococcaceae)，D组标志微生物为肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，E组标志微生物为假单胞细菌科(Pseudomonadaceae)，H组标志微生物为梭杆菌门(Fusobacteria)。

3 讨论

3.1 不同生长阶段大口黑鲈肠道菌群多样性比较

本研究对大口黑鲈9个生长阶段共33个样品的肠道细菌16S rRNA进行了高通量测序，通过α多样性分析，5、6月龄OTU数量，Chao1指数，Shannon指数和Simpson指数均高于其他月龄，在6月龄(B组)均为最大。佟延南等利用同样方法对海南省多个养殖场罗非鱼肠道微生物进行多样性研究，结果显示微生物多样性养殖中期>养殖后期>养殖前期[8]，这与本研究结果存在相似点。不同地域、不同鱼类肠道微生物多样性均在养殖中期出现峰值，反映出可能与鱼类生长发育有较大的相关性。对斑点叉尾鮰[9]和斑马鱼[10]的研究结果也指出，鱼类生长发育过程中肠道微生物类群不断变化，而且这种变化与水环境和饲料改变没有必然联系。

3.2 门和属水平上不同生长阶段大口黑鲈肠道菌群结构比较

在门水平上的分析结果显示，变形菌门、厚壁菌门和梭杆菌门是大口黑鲈肠道的优势菌，在15月龄(H组)二者所占比例之和达到93%以上。雷阳等对双斑东方鲀肠道菌群进行高通量测序分析，发现其肠道菌群主要为变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和梭杆菌门，其中变形菌门为野生双斑东方鲀和养殖双斑东方鲀肠道菌群的优势菌，梭杆菌门在野生双斑东方鲀肠道中占有很大比例[11]。苏月华等研究表明白甲鱼肠道细菌以梭杆菌门、变形菌门、螺旋菌门、厚壁菌门和软壁菌门为主，其中梭杆菌门占比达到70%以上[12]。Wu等用高通量测序方法对草鱼、黄颡鱼肠道菌群进行研究，发现其主要为变形菌门、厚壁菌门、放线菌门[13-14]。以上研究表明，变形菌门、厚壁菌门和梭杆菌门是大多数鱼类肠道微生物的主要菌群。变形菌门是细菌中较大的一个门类，广泛分布于环境和动植物体内[15-19]，门内种类繁多，在哺乳动物中变形菌门被视为肠道菌群失调的微生物标志，研究中变形菌门一直为菌群优势种类，而对其他肉食性鱼类如虹鳟[20]、鳜[21]的研究也表明，变形菌门丰度占绝对优势地位。由此可见变形菌门对宿主的作用机制复杂，尤其对鱼类作用机制还需要进一步研究。厚壁菌门比例上升在哺乳动物中提示为肥胖病，与糖尿病密切相关，而厚壁菌门却为鱼类肠道菌群主要成员；Semova等对无菌斑马鱼的研究表明，肠道菌群可以促进肠上皮及肝组织中的脂肪的吸收并促进脂滴的形成，其中厚壁菌门起到了关键作用[22]。本研究表明大口黑鲈生长过程中厚壁菌门比例逐步下降，可能提示鱼类养殖后期面对脂肪沉积、糖尿病方面的疾病压力更小。梭杆菌门是一类兼性厌氧微生物，能够发酵多糖和蛋白质产生以乙醇和短链脂肪酸，其中短链脂肪酸是鱼肠道中重要的有机酸，肠道内壁细胞基本的代谢能量来源于此，本研究中梭杆菌门在生长后期占比明显增高。

属水平上的分析结果显示，鲸杆菌属、假单胞菌属、支原体属所占比例较大，其中鲸杆菌属在15月龄所占比例达到90.21%。张婧怡等[5]、Tsuchiya等[23]和Kessel等[24]研究表明，罗非鱼不同环境不同阶段肠道鲸杆菌属丰度均较高。胡俊在对鱼类肠道粘附菌群探究中认为鲸杆菌属具有更好的定植能力[25]。此外，鲸杆菌属能够发酵多肽碳水化合物，产生维生素B12，研究中在梭杆菌门中占绝对优势地位，在养殖后期鲸杆菌显著增多。以上研究表明，鲸杆菌属是鱼类肠道菌群的重要组成部分，丰度可能与鱼类发育相关。假单胞菌属为一种条件病原体，在环境良好的情况下，可产生多种抗生素和活性小分子物质，具有抗菌溶菌作用，而在恶劣的环境下会使鱼体表面溃烂，体内肿胀充血等[26]。沈锦玉等从浙江宁波、台州网箱养殖死亡大黄鱼体内分离和鉴定出致病力极强的恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)[27]，刘年锋等对福州地区内脏出现白点的网箱养殖大黄鱼进行研究，分离鉴定出优势致病菌变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)[28]。以上研究表明，假单胞菌属易对宿主产生胁迫作用，需要关注。支原体属广泛存在于动物体内，研究中7月龄(C组)相对丰度为35.24%。Holben等研究表明，支原体属在养殖大马哈鱼(Salmosalar)肠道中的相对丰度分别为25%、81%，在野生大马哈鱼中的相对丰度为96%[29]；Li等对扬子江上游圆口铜鱼(Coreiusguichenoti)的肠道菌群进行研究，发现雌性鱼以支原体属为主[30]。以上研究表明，支原体属在鱼类肠道中广泛存在。