不同果实形状番茄品种茎部内生细菌群落结构及代谢功能特征

2021-02-12陈思宇宋静静杨尚东

西南农业学报 2021年12期

孙妍，陈思宇，肖健，宋静静，杨尚东*

(1.广西大学农学院/植物科学国家级实验教学示范中心，广西南宁 530004；2.广西北部湾海洋生物多样性养护重点实验室/北部湾大学海洋学院，广西钦州 535011)

【研究意义】番茄(SolanumlycopersicumL.)是世界范围内广泛栽培的重要蔬菜之一，含有丰富的有机酸、糖、矿物质、谷胱甘肽、番茄红素和多种维生素等营养成分，有清除自由基、美白和延缓衰老等功效[1]。我国是世界上最大的番茄生产和消费国，种植番茄已成为我国部分农村的脱贫致富途径[2]。番茄果实形状是指示番茄品质的重要指标之一，也是番茄果实分级和育种的重要指标[3]。同时，随着番茄采摘机器人研发的不断深入，控制影响番茄果实形状的因子正日益受到广大科技人员的重视[4]。植物内生菌是能存活在植物各组织和器官内、与宿主植物关系和谐互利的一类微生物[5-6]，具有促进宿主新陈代谢、防虫防病、固氮、固磷和增强植株抗性等生物学作用[7-8]，但对番茄品质尤其是果实形状方面的影响尚不清楚。因此，解析果实形状不同番茄品种植株茎部的内生细菌群落结构，探究内生细菌与果实形状间的相关性，对构建新型番茄育种评价技术体系具有重要意义。【前人研究进展】Rodriguez等[9]利用Tomato analyzer可将番茄果实形状分为扁平、矩形、椭圆形、牛心形、圆形、倒卵形、心形和长形，并发现SUN、OVATE、FAS和LC4个基因对果实形状具有重要影响。番茄果实形状除受基因调控外，还受外界环境、矿质营养水平、激素及病虫害等诸多因素的综合影响[10-13]，如钾元素不仅有助于番茄果实均匀着色，还有助于减少果实表面黄斑和畸形果[3]，磷在番茄果实孕育中发挥着重要作用[14]。此外，在番茄果实发育过程中，植物激素尤其是生长素(IAA)、赤霉素(GA)、乙烯、脱落酸(ABA)和细胞分裂素(CK)也发挥着重要作用，如IAA通过刺激果皮细胞分裂触发番茄坐果，且IAA浓度在果实中心部位最高，明显高于其他果实部位[15-16]；ABA可通过抑制乙烯的产生促进果皮细胞扩张，正向调控番茄细胞生长；GA处理可启动果实发育功能，提高番茄果实坐果率，还可通过促进细胞分裂使果实膨大[17]；ABA通过诱导气孔关闭参与受寒冷和干旱胁迫植物的响应机制[18]；CK可激活花前子房的细胞分裂并导致单性结实，调节果实生长[19]。Kumar等[16]研究还发现，SIIAA9基因表达的变化伴随着乙烯相关基因表达的大量变化，乙烯通过与IAA进行协调作用参与果实坐果过程，因此内源激素IAA和乙烯含量水平对番茄结实的诱导至关重要；ABA合成减少、分解代谢增加或敏感性降低会导致植物气孔关闭失败，果实缺乏ABA会导致蒸腾作用增加，水分亏缺，抑制果实生长。已有研究证实，IAA[20]、CK[21]、ABA[22]、GA[23]和乙烯[24]等植物内源激素的产生与植物内生菌紧密相关。【本研究切入点】虽然前人对番茄果实形状的形成开展了相关研究，但目前关于植物内生细菌对番茄果色、果形和果实甜度等果实品质影响的研究鲜见报道，特别是针对影响果实形状形成特有内生菌属的研究仍缺乏直接证据。【拟解决的关键问题】比较分析4种果实形状番茄品种植株茎部的内生细菌群落结构及代谢功能特征，探究番茄果实形状形成与植株内生细菌的关联性，为构建番茄育种新型评价体系及有益微生物功能的开发利用提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2020年3—6月在广西大学农学院蔬菜基地(东经108°17′25″，北纬22°51′02″)设施大棚内进行。试验地土壤理化性质：pH 5.68，有机质8.92 g/kg，全氮0.55 g/kg，全磷0.67 g/kg，全钾7.51 g/kg，碱解氮15.27 mg/kg，速效磷0.67 mg/kg，速效钾82.8 mg/kg。

1.2 试验材料

供试椭圆形番茄品种为千禧(E)(台湾农友种苗公司)，扁平形番茄品种为桃太郎(F)(日本泷井种苗株式会社)，长型番茄品种为凤珠(L)(台湾农友种苗公司)，圆球形番茄品种为爱丽(R)(日本泷井种苗株式会社)。所有品种均同期育苗、定植及进行常规栽培管理。番茄进入果实成熟期时进行样品采集。每个品种选取3株长势一致的植株，使用经消毒的铁铲和剪刀随机采集茎部样品，送样检测植株茎部内生细菌。

1.3 试验方法

1.3.1 样品总DNA提取、PCR扩增和序列测定利用FastDNA®Spin Kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals，U.S)抽提总DNA，使用NanoDrop2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific，U.S)测定DNA浓度和纯度，最后凝胶电泳检测DNA提取质量。细菌16S rRNA基因V5～V7高变区PCR扩增引物为799F：5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′和1193R：5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′；进行PCR产物鉴定、纯化及定量。Illumina MiSeq测序：以2%琼脂糖凝胶进行PCR产物回收、纯化(Extraction Kit)、Tris-HCl洗脱和电泳检测，并用QuantusTMFluorometer (Promega，USA)对回收产物进行检测定量。使用NEXTFLEX®Rapid DNA-Seq Kit进行建库，利用上海美吉生物医药科技有限公司MiSeq PE300平台进行测序[25]。

1.3.2 测定项目及方法利用Uparse平台对优化序列提取非重复序列，去除无重复的单序列，按照97%相似性对序列进行分类操作单元(OTU)聚类，得到OTU的代表序列，生成OTU表格。采用RDP classifier贝叶斯算法对序列进行分类学分析，对比Silva数据库统计各样本的群落物种组成。

本研究以Shannon与Simpson指数表征细菌群落多样性，以Chao1和Ace指数指示细菌群落丰富度，以覆盖率反映细菌群落的覆盖度。利用R语言工具制作群落柱形图进行分类水平上优势物种组成和相对丰度分析；制作Venn图统计分析样本中所共有和特有的物种OTUs数，以深入了解番茄茎部内生细菌群落组成和结构特征；利用PICRUSt对16S rRNA基因V5～V7高变区扩增序列测序结果进行功能预测，根据KEGG数据库的信息，获得Pathway的2个水平信息及各功能类别的丰度表。

1.4 统计分析

试验数据采用Excel 2019和SPSS 21.0进行统计分析。利用上海美吉生物医药科技有限公司的I-sanger云数据分析平台在线数据进行番茄植株茎部内生细菌群落组成与结构及功能预测。

2 结果与分析

2.1 不同果实形状番茄植株茎部内生细菌的OTUs聚类分析结果

由表1可知，在97%相似度水平对样品序列进行OTU聚类，从4种果实形状番茄的植株茎部内生细菌中共鉴定到31门84纲206目347科655属1045种1660个OTU。其中，椭圆形番茄(E)茎部内生细菌群落由28门57纲155目269科473属701种993个OTU组成；扁平形番茄(F)茎部内生细菌群落由24门55纲148目250科447属660种951个OTU组成；长形番茄(L)茎部内生细菌群落由26门62纲158目267科468属685种977个OTU组成；圆球形番茄(R)茎部内生细菌群落由25门62纲163目272科483属723种1057个OTU组成。

2.2 不同果实形状番茄植株茎部内生细菌的Alpha分析结果

由表2可知，4种果实形状番茄植株茎部内生细菌的覆盖率均在98.0%及以上，说明样本测序数据足够真实，可反映其内生细菌群落的多样性；表征细菌群落多样性的Shannon和Simpson指数间，以及表征丰富度的Chao1和Ace指数间均无显著差异(P>0.05)，说明4种果实形状番茄植株茎部内生细菌均具有相似的多样性和丰富度。

2.3 不同果实形状番茄植株茎部内生细菌的群落组成分析

在门分类水平，不同果实形状番茄植株茎部优势内生细菌(丰度占比大于1.00%)的群落结构极相似，优势细菌门均由放线菌门(Actinobacteriota)、变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、酸杆菌门(Acidobacteriota)和绿弯菌门(Chloroflexi)组成(图1)。其中，椭圆形果实番茄(E)植株茎部内生细菌优势细菌门分类水平的丰度占比排序为放线菌门(45.22%)>变形菌门(34.28%)>厚壁菌门(14.30%)>拟杆菌门(1.72%)>酸杆菌门(1.36%)>绿弯菌门(1.31%)，其他(Others)门的丰度占比为1.80%；扁平形番茄(F)植株茎部内生细菌优势细菌门分类水平的丰度占比排序为变形菌门(46.97%)>放线菌门(32.32%)>厚壁菌门(11.79%)>拟杆菌门(3.32%)>酸杆菌门(2.04%)>绿弯菌门(1.17%)，其他(Others)门的丰度占比为2.39%；长形番茄(L)植株茎部内生细菌优势细菌门分类水平的丰度占比排序为变形菌门(48.15%)>放线菌门(34.96%)>厚壁菌门(11.28%)>酸杆菌门(1.27%)>拟杆菌门(1.19%)>绿弯菌门(1.17%)，其他(Others)门的丰度占比为1.98%；圆球形番茄(R)植株茎部内生细菌优势细菌门分类水平的丰度占比排序为放线菌门(49.28%)>变形菌门(28.53%)>厚壁菌门(15.13%)>酸杆菌门>(1.76%)>绿弯菌门(1.74%)>拟杆菌门(1.34%)，其他(Others)门的丰度占比为2.23%。

表1 不同果实形状番茄植株茎部内生细菌在不同分类水平的数量

表2 不同果实形状番茄植株茎部内生细菌的多样性指数比较

图1 不同果实形状番茄植株茎部优势内生细菌门分类水平的相对丰度占比比较Fig.1 Comparison of the relative abundance of dominant endophytic bacteria in stems of tomato plant with different fruit shapes at phylum level

图2 不同果实形状番茄植株茎部优势内生细菌属分类水平的相对丰度比较Fig.2 Comparison of the relative abundance of dominant endophytic bacteria in stems of tomato plant with different fruit shapes at genus level

在属分类水平，不同果实形状番茄植株茎部共有的优势内生细菌属(丰度占比大于1.00%)均为青枯菌属(Ralstonia)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、短颈细菌属(Brevibacterium)、短状杆菌属(Brachybacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)和红球菌属(Rhodococcus)(图2)。其中，青枯菌属在果实长

表3 不同果实形状番茄植株茎部优势内生细菌属分类水平的相对丰度占比比较

形番茄植株茎部的细菌属中的丰度占比达32.83%，而在椭圆形番茄、圆球形番茄和扁平形番茄植株茎部的细菌属中的丰度占比分别仅为2.55%、2.83%和2.83%。此外，果实椭圆形番茄植株茎部特有的优势内生细菌属为乳酸杆菌属(Lactobacillus)、甲基杆菌—甲基罗布氏菌属(Methylobacterium-Methylorubrum)、拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)和未分类产碱杆菌属(norank_f__Alcaligenaceae)；果实扁平形番茄植株茎部特有的优势内生细菌属为鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、未分类盐单胞菌属(unclassified_f__Halomonadaceae)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、norank_f__Mitochondria、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)和Massilia；果实长形番茄植株茎部特有的优势内生细菌属为Leucobacter、未分类黄色单胞菌属(unclassified_f__Xanthomonadaceae)和地微杆菌属(Geomicrobium)；果实圆球形番茄植株茎部特有的优势内生细菌属为棒状杆菌属(Corynebacterium)、魏斯氏菌属(Weissella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、unclassified_f__Rhodanobacteraceae和短小杆菌属(Curtobacterium)；未分类的大肠杆菌属(unclassified_f__Enterobacteriaceae)在果实长形番茄植株中不存在，但在果实椭圆形、圆球形和扁平形番茄植株茎部的细菌属中的丰度占比分别达7.91%、5.12%和3.95%(表3)。

2.4 不同果实形状番茄植株茎部细菌群落的物种Venn图分析

由Venn图分析结果(图3)可知，在OTU分类水平，果实椭圆形番茄的植株茎部与其他果形番茄的植株茎部共有内生细菌OTUs为993个，特有内生细菌OTUs为154个；果实扁平形番茄的植株茎部与其他果形番茄的植株茎部共有内生细菌OTUs为951个，特有内生细菌OTUs为109个；果实长形番茄的植株茎部与其他果形番茄的植株茎部共有内生细菌OTUs为977个，特有细菌OTUs为142个；果实圆球形番茄的植株茎部与其他果形番茄的植株茎部共有内生细菌OTUs为1057个，特有细菌OTUs为184个；四者共有内生细菌OTUs为501个。

从图4可看出，在属分类水平，4种果实形状番茄的植株茎部中共有内生细菌属310个；果实椭圆形番茄的植株茎部特有内生细菌属42个；果实扁平形番茄的植株茎部特有内生细菌属23个；果实长形番茄的植株茎部特有内生细菌属为38个；果实圆球形番茄的植株茎部特有内生细菌属为49个。

2.5 PICRUSt功能预测

为了获得不同果实形状番茄植株茎部内生细菌的功能，本研究利用高通量测序技术和KEGG数据库进行比对，发现4种果实形状番茄的植株茎部内生细菌在一级功能层共有代谢(Metabolism)、环境信息处理(Environmental information processing)、遗传信息处理(Genetic information processing)、细胞过程(Cellular processes)、人类疾病(Human diseases)和有机系统(Organismal systems)6类生物代谢通路(图5)。其中，代谢均为4种果实形状番茄的植株内生细菌主要功能组成，在椭圆形、扁平形、长型和圆球形番茄植株茎部的6类生物代谢通路中占比分别为78.16%、77.14%、77.95%和78.82%；环境信息处理在椭圆形、扁平形、长型和圆球形番茄植株茎部的6类生物代谢通路中占比分别为6.24%、7.07%、6.20%和5.72%；遗传信息处理在椭圆形、扁平形、长型和圆球形番茄植株茎部的6类生物代谢通路中占比分别为5.75%、5.55%、5.65%和6.06%；细胞过程在椭圆形、扁平形、长型和圆球形番茄植株茎部的6类生物代谢通路中占比分别为4.41%、4.81%、4.51%和4.10%；人类疾病在椭圆形、扁平形、长型和圆球形番茄植株茎部的6类生物代谢通路中占比分别为3.50%、3.65%、3.76%和3.35%；有机系统在椭圆形、扁平形、长型和圆球形番茄植株茎部的6类生物代谢通路中占比分别为1.94%、1.78%、1.94%和1.94%。可见，代谢功能是4种果实形状番茄的植株内生细菌最主要功能。此外，椭圆形和圆球形番茄植株茎部内生细菌的代谢功能预测基因拷贝数高于相应的扁平形和长型番茄；不同果实形状番茄植株茎部内生细菌基因一级功能层预测基因种类无显著差异，但基因拷贝数占比存在差异。

图3 不同果实形状番茄植株茎部内生细菌OTUs分类水平的Venn图分析结果Fig.3 Venn diagram of endophytic bacteria at OTUs level in stem of tomato plant with different fruit shapes

图4 不同果实形状番茄植株茎部内生细菌属分类水平的Venn图分析结果Fig.4 Venn diagram of endophytic bacteria at genus level in stem of tomato plant with different fruit shapes

图5 预测功能基因在不同番茄植株茎部内生细菌间的差异(一级功能层)Fig.5 Predicting differences in functional genes among endophytic bacteria in the stems of different tomato plants(hierarchy level 1)

对4种果实形状番茄的植株茎部内生细菌基因进行二级功能预测分析，结果(图6)发现其二级功能层均主要由全貌总述图(Global and overview maps)、碳水化合物代谢(Carbohydrate metabolism)、氨基酸代谢(Amino acid metabolism)、能量代谢(Energy metabolism)、辅因子和维生素的代谢(Metabolism of cofactors and vitamins)、膜转运(Membrane transport)、信号传导(Signal transduction)、异生物质的生物降解和代谢(Xenobiotics biodegradation and metabolism)和细胞群落—原核生物(Cellular community-prokaryotes)等46个子功能组成，其中，果实圆球形番茄植株茎部内生细菌的全貌总述图、氨基酸代谢、辅因子和维生素的代谢、类脂物代谢作用(Lipid metabolism)和翻译(Translation)等15个二级功能层预测基因拷贝数占比较多；果实扁平形番茄植株茎部内生细菌的碳水化合物代谢、能量代谢、膜转运、信号传导和细胞群落—原核生物等14个二级功能层预测基因拷贝数占比较多；果实长形番茄植株茎部内生细菌的异生物质生物降解和代谢、细胞生长和死亡(Cell growth and death)、癌症：概述(Cancer:overview)和神经退行性疾病(Neurodegenerative disease)等13个二级功能层预测基因拷贝数占比较多；果实椭圆形番茄植株茎部内生细菌的老化(Aging)、转运和分解代谢(Transport and catabolism)、免疫系统(Immune system)和免疫性疾病(Immune disease)4个二级功能层预测基因拷贝数占比最多。

综上所述，虽然4种果实形状番茄植株茎部内生细菌基因的二级功能层预测基因种类相近，但基因拷贝数四者间存在明显差异。由此推测，不同果实形状番茄植株间内生细菌群落组成、结构及其功能基因种类和丰度的差异可能是造成植株内部合成代谢途径、占比、营养成分、酶和激素种类及其含量水平产生差异的因素，进而使得不同番茄品种果实呈现不同的形状。

3 讨论

已有研究表明，内生细菌寄居于植物组织中，与寄主植物建立了和谐互作的良好关系，具有固氮、促进植物生长、抗病虫害及抗病原真菌等作用，还可改变酶活性，进而调节寄主植物的新陈代谢[26-29]；在涉及番茄果实形状的4个基因中，SUN基因编码IQD家族的钙调素结合蛋白影响果实伸长，OVATE基因编码OVATE家族蛋白调控转录而影响果实伸长，LC基因主要控制分生组织大小及腔室数量，FAS基因编码YABBY家族调控腔室数量诱导果实扁平或卵圆形伸长，但番茄果实形状除受品种基因调控外，还受营养、内源激素水平和环境(光照、温度和水分)等因素影响[30]。近年来，随着人们认知水平的不断提升，已发现植物内源激素的形成与微生物间存在紧密联系，如IAA和CK含量与酸杆菌门和绿弯菌门细菌丰度占比间呈显著正相关，与厚壁菌门细菌丰度占比呈显著负相关；ABA含量与放线菌门细菌丰度占比呈显著正相关，与变形菌门、绿弯菌门细菌丰度占比呈显著负相关[31]。本研究结果与上述研究结果相似。

图6 预测功能基因在不同番茄植株茎部内生细菌间的差异(二级功能层)Fig.6 Predicting differences in functional genes among endophytic bacteria in the stems of different tomato plants(hierarchy level 2)

本研究结果表明，在门分类水平，不同果实形状番茄植株茎部的内生细菌群落结构相似，优势细菌门类均由放线菌门、变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、酸杆菌门和绿弯菌门细菌组成，但优势细菌门的丰度占比在不同果实形状番茄植株茎部表现各异。其中，果实长形和扁平形番茄植株茎部中丰度占比最高的优势内生细菌门为变形菌门，占比分别达48.15%和46.97%；果实椭圆形和圆球形番茄植株茎部中丰度占比最高的优势内生细菌门为放线菌门，占比分别达45.22%和49.28%，而变形菌门细菌的丰度占比仅分别为34.28%和28.53%。由于ABA含量与放线菌门细菌丰度占比呈正相关、与变形菌门细菌丰度占比呈负相关，由此推测，相比于果实椭圆形和圆球形番茄品种，果实长形和扁平形番茄品种植株茎部可能会形成ABA含量更高的环境；内源ABA可抑制番茄果实纵向生长[32]，因此ABA可调控番茄果实形状倾向于形成椭圆形或圆球形。

乳酸杆菌属[33]、寡养单胞菌属[34]、葡萄球菌属[35-36]和短小杆菌属[37-38]细菌是果实椭圆形或圆球形番茄品种植株茎部特有的优势内生细菌属。其中，乳酸杆菌属细菌是一类通过产生乳酸降低内生环境pH、有益于植株健康的微生物，寡养单胞菌属细菌具有ACC脱氨酶活性，可调控乙烯的合成，进而增强植株抗逆性，葡萄球菌属可将难溶性有机/无机磷转化成有利于植株吸收的可溶性磷酸盐，改善作物磷素营养供应，提高土壤肥力，短小杆菌属具有固氮能力，可提高植株氮利用率，增加果实产量的效果。本研究中，在属分类水平，青枯菌属、假诺卡氏菌属、短颈细菌属、短状杆菌属、芽孢杆菌属和红球菌属细菌均是4种果实形状番茄的植株茎部中共有优势内生细菌属；果实形状不同番茄的植株茎部中也富集了各自特有优势内生细菌属，其中，果实椭圆形番茄的植株茎部特有优势内生细菌属为乳酸杆菌属、甲基杆菌—甲基罗布氏菌属、拟无枝酸菌属、寡养单胞菌属和未分类产碱杆菌属；果实扁平形番茄的植株茎部特有优势内生细菌属为鞘脂单胞菌属、未分类盐单胞菌属、拟诺卡氏菌属、norank_f__Mitochondria、鞘氨醇杆菌属和Massilia；果实长形番茄的植株茎部特有优势内生细菌属为Leucobacter、未分类黄色单胞菌属和地微杆菌属；果实圆球形番茄的植株茎部特有优势内生细菌属为棒状杆菌属、魏斯氏菌属、葡萄球菌属、unclassified_f__Rhodanobacteraceae、短小杆菌属。由此推断，本研究中果实椭圆形或圆球形番茄植株茎部能富集有别于果实长形或扁平型番茄植株茎部的特有优势内生细菌属，因此可形成诸如内源激素种类与含量、汁液pH及植株内部营养水平等环境因子有异于果实长形或扁平型番茄植株的内部环境，进一步诱导果实形状不同番茄品种中不同功能基因表现出显性或隐性状态，促使该环境下“启动”的功能基因调控形成不同形状的番茄果实。