酵母有丝分裂染色体异常分离机制

魏文青 谢泽雄

（天津大学化工学院 系统生物工程教育部重点实验室 教育部合成生物学前沿科学中心，天津 300072）

有丝分裂过程发生染色体分离错误，导致子代细胞增加或减少部分甚至整条染色体的现象称为非整倍体化［1］。非整倍体是常见的细胞生理现象，存在于植物、动物、真菌等生命体中，影响疾病发生、生物进化、细胞应激等过程［2］。比如常见的唐氏综合征（21三体综合征）和爱德华氏综合症（18三体综合征）等非整倍体疾病的发生［3］。非整倍体诱导的基因组不稳定性是驱动恶性肿瘤生长的重要因素。酵母菌被广泛的应用于生物学、医学研究和工业生产等过程，在自然界中一般以单倍体或者二倍体形式存在［4-5］。非整倍体酵母细胞通常会表现出多种形式的基因组不稳定性，如细胞内染色体丢失频率增加，有丝分裂重组事件以及DNA损伤修复缺陷等（图1）。Deutschbauer等［6］对基因杂合缺失的二倍体酿酒酵母菌株进行适应性分析，以确定细胞中所有导致单倍剂量不足的生长缺陷基因。通过将完整酿酒酵母菌株中测试得到的184个基因进行敲除发现，这些基因处于杂合状态时细胞的增殖能力会降低。所以非整倍体基因剂量的失衡会显著降低细胞的适应性，甚至导致细胞死亡［7］。非整倍体酿酒酵母细胞还会出现明显的G1期延迟，细胞的长度发生变化等现象［8］。因此解析细胞分裂过程中染色体异常分离的机制，对于调控细胞完成正常增殖过程，以及理解和治疗非整倍体疾病都是至关重要的。

图1 酵母非整倍体的形成及影响Fig.1 Formation and influence of yeast aneuploidy

酵母主要分为芽殖酵母和裂殖酵母，其中裂殖酵母主要通过有性繁殖和无性繁殖两种方式进行细胞分裂。通常在营养环境充足的条件下，裂殖酵母主要通过有丝分裂的方式进行一分为二的繁殖［9］，芽殖酵母主要通过出芽和接合两种方式进行繁殖，不同接合型的细胞既可以单独进行有丝分裂出芽繁殖，也可以与不同接合型细胞进行接合并在一定的条件下开始减数分裂过程［10］。故酵母在不同的繁殖方式中都有可能发生错误，形成非整倍体细胞。其中芽殖酵母中比较典型的是酿酒酵母，综合目前研究发现，酿酒酵母细胞在有丝分裂过程中主要通过“染色体提前分离”和“不分离”两种方式形成非整倍体［11］。

1 有丝分裂过程染色体提前分离

染色体提前分离是指细胞有丝分裂中期染色体无法正确排列在赤道板上，姐妹染色单体出现提前分离的现象［12-14］。染色体提前分离的原因主要包括姐妹染色单体黏结蛋白缺陷和纺锤体组装监控机制失效。研究表明这两种原因都会导致非整倍体子代细胞产生。

1.1 姐妹染色单体黏结蛋白缺陷

黏结蛋白是一种最早在酵母细胞中发现的多亚基复合物，主要由Smc1、Smc3、Scc1和Scc3四个核心亚基组成，在姐妹染色单体的聚合、分离和DNA修复过程中发挥重要的作用［14］。有丝分裂S期形成的姐妹染色单体被黏结蛋白聚合在一起，M期黏结蛋白被酶水解后姐妹染色单体在纺锤体的牵引下向细胞两极移动，若此过程黏结蛋白发生缺陷则会导致姐妹染色单体因黏聚力缺失而提前分离，随后纺锤体与姐妹染色单体之间将会发生随机结合，错误的结合将会导致非整倍体细胞的产生［15］。

关于酿酒酵母细胞黏结蛋白如何将姐妹染色单体聚合的模型主要有3类，分别包括单环模型、双环模型以及聚合杆状模型。其中单环模型是最常见的模型，即Smc1、Smc3和Scc1/ Scc3形成一个大三角环状黏结蛋白复合物，能够环抱捕获两个长度约为10 nm的姐妹染色单体［16］。黏结确立蛋白1（Eco1）是一种乙酰转移酶，是调节黏结蛋白形成的重要因子［17］。Eco1最早在酵母中鉴定成功，在有丝分裂S期促进黏结蛋白亚基乙酰化修饰，形成环状结构束缚姐妹染色单体［18］。Zhang等［19］通过研究酵母细胞Smc3亚基上，受Eco1乙酰化修饰的两个赖氨酸位点（K112和K113）突变的影响，实验发现Eco1对黏结蛋白的修饰作用受到突变的破坏，导致姐妹染色单体黏结蛋白缺陷，子代细胞出现非整倍体现象。

双环模型，即每个黏结蛋白环都捕获一个姐妹染色单体。当两个环产生桥接即Smc1和Smc3形成二聚体环产生内聚力，将姐妹染色单体聚合［20］。同样，Eco1/Ctf7乙酰转移酶活性的缺失也会显著影响双环模型中黏结蛋白聚合姐妹染色单体的效果［16］。Zhang等［21］利用酵母双杂交测定法分析黏结蛋白复合物亚基之间的相互作用，实验发现黏结蛋白复合物中不同亚基之间会出现共同免疫沉淀现象，但是当每个亚基单独存在时则不显示相似结果，这证明了双环模型相比单环模型维持染色单体内聚的灵活性更好。

聚合杆状模型是指多个Smc1和Smc3组成的异源二聚体之间形成聚合杆状环绕姐妹染色单体［22］。黏着蛋白与着丝粒特定作用的区域称为染色体附着区。Surcel等［23］利用微染色体亲和纯化的方法，从芽殖酵母中分离出含有染色体附着区的微染色体，并利用透射电镜拍摄和生化分析发现黏结蛋白是杆状的，且与姐妹染色单体相互作用。实验还发现DNA的断裂会直接影响聚合杆状模型与微染色体的结合，说明黏结蛋白与姐妹染色单体之间的联系是拓扑结构而不是简单的物理连接。因此黏结蛋白能够行使正常活性功能的前提是保证黏结蛋白亚基的乙酰化修饰过程正常。未来关于黏结蛋白的研究还可以通过拓展新的方法，探寻并可视化黏结蛋白聚合姐妹染色单体的实际构象。

1.2 纺锤体组装监控机制失效

纺锤体组装检查点（spindle assembly checkpoint，SAC）最早发现于酿酒酵母细胞中，是一套精确的反馈调节系统［24］。纺锤体组装监控机制通过监控有丝分裂后期开启，确保启动前姐妹染色单体与纺锤体微管连接正确。酿酒酵母细胞中的独立遗传学筛选实验首次发现Mad1、Mad2、Mad3、Bub1和Bub3（纺锤体检查点动粒蛋白基因）基因参与酵母细胞纺锤体组装监控通路［25］。后续研究发现纺锤体极复制基因（Msp1）和极光激酶B基因（AuroraB）也是SAC的组成成分［26］。有丝分裂前中期，Mad2基因编码的蛋白能够感应细胞中未与纺锤体微管正确连接的动粒发出的信号［27］。促进后期复合体（anaphase promoting complex/cyclosome，APC/C），是指含有多个亚基的E3泛素连接酶，参与调控细胞周期从中期向后期过渡，是SAC激活的关键底物［28］。Mad1通过发生磷酸化改变Mad2的构象，促使O-Mad2（Open-Mad2）转化为具有稳定活性的C-Mad2（Closed-Mad2）构型，并结合APC/C的关键激活因子Cdc20形成有丝分裂检查点复合物（MCC）［29-30］。MCC通过抑制APC/CCdc20的活性延迟酵母细胞有丝分裂后期的开始（图 2）［31］。

图2 姐妹染色单体黏结蛋白与纺锤体监控机制Fig.2 Sister chromatid adhesion protein and spindle monitoring mechanism

泛素化是指泛素分子特定连接蛋白Lys位点进行的修饰作用。泛素化修饰过程主要有泛素活化酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3三种酶参与，调节蛋白质的泛素化水平［32］。Reddy［33］等发现纺锤体检查点的失效是一个耗能的过程，并依赖于APC/C的多泛素化过程。实验通过在细胞中过表达APC/C，观察到APC/C发生多泛素化作用会导致Mad2从Cdc20上解离，使纺锤体组装监控机制失效。

磷酸化修饰是指将ATP的磷酸基团加载到特定蛋白质上的过程，需要磷酸转移酶的调控作用［34］。Wartrin等［35］发现发生DNA损伤的细胞存活率会显著降低且染色体变异事件增加，黏结蛋白在进行细胞DNA损伤修复的同时亚基Smc1和Smc3发生磷酸化作用，也会导致SAC功能缺陷。此外，Lopes等［36］发现SAC基因尤其关键组分（如Mad2）失活或表达不足也会导致SAC失效，进而产生非整倍体细胞甚至诱导肿瘤的发生。

综上所述，有丝分裂过程中染色体的正常分离需要功能正常的SAC蛋白维持和调控。若SAC相关亚基的泛素化、磷酸化以及基因表达不足都会导致纺锤体组装监控机制失效，并对非整倍体现象普遍存在的癌症的发生具有促进作用［37］。

2 有丝分裂过程染色体不分离

有丝分裂过程染色体不分离是指细胞分裂后期姐妹染色单体无法正常分离，一起进入相同子细胞核中，形成染色体数目不均等的子细胞［38］。总结介绍酿酒酵母有丝分裂染色体不分离的原因主要有两个，动粒与纺锤体微管连接错误和多中心体途径。其中动粒与纺锤体连接错误在酵母细胞中发生的频率较高，相关的研究结果比较充分。多中心体途径在一些疾病的发生过程中较为常见。

2.1 动粒-纺锤体微管连接错误

动粒是着丝粒上的多亚基蛋白复合物，对于有丝分裂染色体的正确分离起着决定性作用［39］。Dam1复合体位于动粒的外层，是动粒的重要组分之一，在动粒与微管之间起重要的连接作用［40］。动粒在有丝分裂过程中的作用主要包括3个方面，（1）动粒与染色体的运动密切相关，即微管与动粒正确连接且满足张力时，染色体运动并促进有丝分裂后期进程的开始；（2）纺锤体微管通过与动粒连接捕获姐妹染色体单体；（3）由动粒通过感知微管连接的张力大小决定纺锤体检查点的激活或沉默［41］。目前关于酿酒酵母动粒的研究较为深入，许多组成动粒模型的相关蛋白或者亚基都是高度保守的［42］。

有丝分裂早期动粒与纺锤体微管的结合不稳定，可能会发生连接错误［43］。酵母细胞动粒与微管错误结合的方式主要有3种：Monotelic连接、Syntelic连接和Merotelic连接（图3-a）。Monotelic连接（单极连接）是指有丝分裂中期一对姐妹染色体单体中只有一条染色体的动粒与一极纺锤体微管连接，而另一条染色单体的动粒没有被纺锤体微管捕获连接［44］。Cheeseman等［45］通过在酵母细胞内构建荧光表达蛋白鉴定证明出4个组成Dam1复合体的新亚基，且无法实现磷酸化的Dam1复合体不能及时建立正确的动粒-微管连接，从而导致Monotelic连接在有丝分裂后期出现。

Syntelic连接（同极连接）是指一对姐妹染色单体的动粒都与一侧纺锤体微管连接。有丝分裂中期纺锤体组装监控机制在接收到Monotelic连接、Syntelic连接的信号后，会延迟细胞有丝分裂后期的开始。若纺锤体组装检查点的功能失活，有丝分裂后期开始前动粒-微管的错误连接则得不到纠正，最终会造成细胞有丝分裂后期一条甚至多条染色体不分离的现象［46］。极光激酶是调控细胞有丝分裂过程正确进行的一类重要丝氨酸激酶，极光酶B在校正酵母细胞动粒-微管连接错误事件中发挥重要的作用［47］。缺陷的极光酶B无法感知动粒-微管中产生的张力变化，从而导致细胞中出现Syntelic连接［48-49］。

Merotelic连接（梅洛蒂克连接）是指一对姐妹染色单体中有一个染色体的动粒与两极纺锤体微管都发生连接，且有丝分裂后期Merotelic连接的染色单体会依据连接两极微管的多少进行运动定位。Gregan等［50］认为Merotelic连接是生物有丝分裂过程形成非整倍体的主要机制，同时也是促进癌细胞染色体不稳定的主要原因。所以动粒与纺锤体微管之间正确连接的关键是动粒能否正常发挥功能，以及感知动粒-微管连接张力变化的极光激酶是否可以正常接收信号。

2.2 多中心体途径

中心体是主要的微管组织中心，不仅调控微管的成核运动，而且推动着细胞有丝分裂进程［51］。每个细胞周期中心体仅复制一次，复制形成的两个中心体产生微管并移动到细胞两极。若细胞不能正确调控中心体的复制将会出现中心体数目异常现象［52-54］。当细胞中中心体数量超过两个时，便会出现纺锤丝与动粒之间短暂的多极连接，姐妹染色单体因受力不均匀分离形成非整倍体子细胞［55］（图 3-b）。

图3 动粒-微管结合错误和多中心体途径Fig.3 Miscellaneous kinetochore-microtubule binding and polycentric pathway

多中心体产生的原因主要包括：中心体扩增、中心粒聚合缺陷以及中心体片段化［56］。Polo样蛋白激酶4（PLK4）是参与调控中心体复制过程的重要组分，当PLK4过表达时中心体复制机制会发生缺陷，将会导致一个细胞周期内中心体发生多次复制［57-58］。Meraldi等［59］进行细胞中心体复制实验发现，E2F转录因子和Cdk2-周期蛋白A活性的激活也是中心体复制必须的。所以这些蛋白或因子的过表达都有可能促使细胞内中心体的扩增。

然而当细胞中某些蛋白表达不足时，中心粒之间的聚合张力会降低甚至消失，导致中心粒聚合发生缺陷［60］。此外，中心体结构的缺陷可能导致片段化的中心粒与微管连接形成极纺锤体［57］。以上3种多中心产生的机制都会导致细胞发生多极分裂，即有丝分裂过程形成3个甚至更多个子细胞核。很多研究表明多极分裂最终导致非整倍体细胞的产生，尤其在多种癌症的发生中较为明显［61］。

3 总结与展望

随着生物学技术的发展，对酵母有丝分裂过程中染色体异常分离机制的研究已经有了显著的成果。从最初的细胞学观察到如今深层次的遗传学研究，发现很多蛋白和调节因子参与有丝分裂染色体分离，并且起到密切的调控作用。但是综合目前的研究会发现还有很多蛋白或亚基的作用机制未阐释清晰，如调节动粒-微管连接的Dam1复合体相关亚基。此外，是否还有新的调控蛋白或通路未发现对于研究者而言也是一个挑战。其次，染色体分离异常直接导致非整倍体的产生。现有的研究都表明非整倍体是癌症细胞的显著特征，增加了癌细胞基因组的不稳定性，但是非整倍体与肿瘤发生的关系亟待进一步的研究阐明。最后，在酵母细胞中染色体分裂异常也会导致多倍体细胞的形成，但是多倍体细胞与非整倍体细胞之间的调控关系仍是一个悬而未决的问题。系统且全面的了解和建立不同物种非整倍体形成方式及调控网络是必要的，缩小研究的成本及时间范畴，探寻和解释细胞有丝分裂染色体分离异常的原理，并应用其解决与人类息息相关的实际问题是本研究的终极任务。